【技术实现步骤摘要】
一种中国石竹DchCHS1基因过表达载体制备方法及其应用
[0001]本专利技术属于基因过表达载体
，具体涉及一种中国石竹DchCHS1基因过表达载体制备方法及其应用。
技术介绍
[0002]基因的瞬时表达常被用作研究植物基因功能的重要技术手段，可以将携带外源基因的载体快速导入宿主细胞并被进行高效表达或沉默。基因产物在短时间内被检测到，其转化效率高于传统转基因方式，且生物安全性高，可以有效解决转基因实验周期长、某些难建立体系的植物基因功能验证等问题。近几年，已以杜梨叶片、刚毛柽柳组培幼苗、月季和百合的花瓣、半夏的愈伤组织、叶片和叶柄，莴苣的叶片和果实为材料，成功建立了相应植物的基于农杆菌介导的瞬时表达体系。
[0003]中国石竹(Dianthus chinensis)可适应多种环境，在城市景观中被广泛应用。同时中国石竹也是一种中药材。查尔酮合成酶(Chalcone synthase，CHS)是花色素苷合成途径的第一关键酶，抑制或过量表达该基因可改变花色。黄酮是一种很强的抗氧剂，可有效清除体内的氧自由基，其阻止氧...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种中国石竹DchCHS1基因过表达载体制备方法，其特征在于，该方法为：S1、提取中国石竹Dianthus chinensis叶片的总RNA，并反转录成cDNA；S2、以S1中得到的cDNA为模板，用引物DchCHS1
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F1和引物DchCHS1
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R1为引物进行DchCHS1基因的PCR扩增，得到PCR产物；所述DchCHS1基因的PCR扩增的反应体系为：cDNA 2μL、Taq Mix 12.5μL、引物DchCHS1
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F1 1μL、引物DchCHS1
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R1 1μL、dd H2O补足至25μL；所述DchCHS1基因的PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，72℃退火30s，72℃延伸60s，共34个循环；72℃延伸5min；所述引物DchCHS1
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F1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述引物DchCHS1
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R1的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；S3、将S2中得到的PCR产物用胶回收试剂盒进行切胶回收后，将纯化后的DchCHS1目的片段与经EcoR I酶切的pMD19
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T载体在T4连接酶的作用下在温度为16℃的条件下连接反应12h，得到连接产物；所述连接反应的体系为：DchCHS1目的片段3μL、经EcoR I酶切的pMD19
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T载体1μL、T4连接酶1μL、T
4 DNA连接酶缓冲液1μL，dd H2O补足至10μL；S4、将S3中得到的连接产物与100μL的DH5α感受态细胞混匀，冰浴30min后，42℃热激1min，置于冰上静置1min，加入900μL的SOC培养基，175rpm、37℃振荡培养45min～60min，将菌液涂布在LB固体培养基上，在温度为37℃的条件下培养12h后，挑取白色单菌落于10μL的dd H2O中，用引物DchCHS1
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F1和引物DchCHS1
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R1进行菌液PCR检测，得到与S3中所述DchCHS1目的片段大小相同的条带，选取清晰明亮条带对应的白色单菌落，于10mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中振荡培养12h～16h，提取质粒，经BamH I/Sma I双酶切验证，获得与S3中所述DchCHS1目的片段大小相同的酶切片段，将酶切验证正确的质粒进行测序，获得的测序结果与中国石竹DchCHS1基因进行比对，若核苷酸序列相同，即为克隆成功，相应的S3中所述连接产物即为pMD19
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T
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DchCHS1质粒；所述LB固体培养基中氨苄青霉素的质量浓度为50mg
·
L
‑1、X
‑
gal的质量浓度为40mg
·
L
‑1、IPTG的质量浓度为24mg
·
L
‑1；S5、将pBI121
‑
GUS表达载体和S4中得到的pMD19
‑
T
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DchCHS1质粒分别进行BamH I/Sma I双酶切后连接，得到pBI121
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DchCHS1
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GUS质粒；酶切反应体系为：pMD19
‑
T
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DchCHS1重组质粒或者pBI121
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GUS表达载体15μL、BamHI内切酶1μL、Sma I内切酶1μL、BSA5μL、10
×
T Buffer 5μL、dd H2O 23μL；S6、将S5中得到的pBI121
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DchCHS1
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GUS质粒转化至DH5α感受态细胞中，涂布于含40mg<...
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