菠萝AcKNOX1基因、克隆方法、表达载体及应用技术

本发明专利技术公开菠萝AcKNOX1基因、克隆方法、表达载体及应用，提取菠萝总RNA，反转录合成cDNA，以此为模板，设计特异引物，利用PCR方法获得AcKNOX1基因的全长cDNA，与载体连接，转化大肠杆菌Trans

【技术实现步骤摘要】
菠萝AcKNOX1基因、克隆方法、表达载体及应用


[0001]本专利技术属于生物
，涉及菠萝AcKNOX1基因、克隆、表达特性分析、表达载体构建、对乙烯的响应途径和对开花的调控作用。

技术介绍

[0002]菠萝(Ananas comosus)隶属于凤梨科(Bromeliaceae)凤梨属(Ananas)，作为一种热带季节性水果以其优良的营养特性而闻名，也是全球最具有经济价值的水果之一。在菠萝众多的品系中，其叶缘形态可分为三类：完全无刺、完全有刺和部分有刺。近年来，我国菠萝产业一直保持稳定发展态势，但远不能满足市场需求，产品主要依赖于进口。除受限于种植区域，菠萝有刺品种的叶刺，给栽培管理和人工采收造成很多不便，劳动力成本上升的同时也妨碍了有刺品种的引进。若能培育出刺少甚至无刺的菠萝品种，将极大提高菠萝田间管理的工作效率。因此培育无刺品种，是菠萝育种的重要目标之一，也是菠萝育种的关键问题。虽然利用分子手段改良菠萝叶缘的案例未见报道，但随着对叶缘锯齿研究的深入，人为调控植物叶缘性状成为可能，该研究将为无刺品种的开发提供理论指导。
[0003]通过菠萝比较转录组信息分析获得了KNOX1基因的片段，BLAST对比显示均与其他植物中的KNOX1基因具有较高的同源性，定名为AcKNOX1。实时荧光定量PCR结果表明，基因表达分析表明，在不同形态的叶缘中，AcKNOX1基因在无叶刺菠萝叶边缘中相对表达量显著低于有叶刺菠萝；赤霉素、细胞分裂素和脱落酸三种激素处理菠萝幼苗后，AcKNOX1在菠萝幼苗中的表达量呈现先上升后下降的趋势，且分别在8h、12h和12h相对表达量达到峰值，表明这三种激素均能诱导AcKNOX1基因的表达。亚细胞定位鉴定发现其可在细胞核发挥功能；克隆获得AcKNOX1启动子并分析其具有光响应元件、厌氧诱导顺式调控元件和环境胁迫响应元件等调控元件，表明AcKNOX1基因可能还参与其它生物学途径。利用PCR克隆了基因的全长序列并构建表达载体，转35S::AcKNOX1阳性植株幼苗期叶片即出现裂刻，生长过程中叶面向内皱缩，叶缘裂刻加深，叶表皮毛明显增加，表明菠萝AcKNOX1基因可能影响菠萝叶缘发育过程。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种菠萝AcKNOX1基因，提取菠萝总RNA，反转录合成cDNA，以此为模板，设计特异引物，利用PCR方法获得AcKNOX1基因的全长cDNA，与
‑
blunt载体连接，转化大肠杆菌Trans
‑
T1感受态细胞，挑取阳性克隆得到菠萝AcKNOX1基因，该基因的cDNA全长1508bp。AcKNOX1基因的获得，为研究菠萝叶刺形成机理奠定了基础，为菠萝功能基因的克隆与鉴定、无刺品种种质资源的鉴定评价及无刺品种选育提供依据，具有重要的理论及实践意义。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术的技术方案为：提供一种菠萝AcKNOX1基因，该基因序列具有序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
[0006]本专利技术的另一目的在于提供一种菠萝AcKNOX1基因的克隆方法，包括以下步骤：
[0007](1)以菠萝(Aechemia fasciata)为材料，利用CTAB法提取总RNA；
[0008](2)AcKNOX1基因的克隆；
[0009](2
‑
1)cDNA模板合成利用Trans
‑
Uni One
‑
Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(Transgene)试剂盒，作为PCR模板备用；
[0010](2
‑
2)设计全长cDNA扩增引物；
[0011]AcKNOX1基因cDNA全长克隆引物
[0012][0013](2
‑
3)根据引物的Tm值进行PCR条件的优化后，进行PCR扩增，并将获得的产物连接到
‑
blunt载体，并转化大肠杆菌感受态Trans
‑
T1，经PCR和酶切鉴定后进行测序。
[0014]PCR体系及条件为：
[0015][0016][0017]获得全长的cDNA为1508bp，包括部分起始密码子前的5
’
UTR和终止密码子后的3
’
UTR。开放阅读框部分为987bp，由此推得编码含329个氨基酸残基的蛋白质，将此氨基酸序列在国际基因库中进行保守结构域分析，具有KNOX I类亚家族保守功能结构域。
[0018]进一步地，步骤(1)总RNA的提取具体如下：
[0019](1
‑
1)准备工作：将研钵提前放入烘箱180℃烘4h后冷却至室温待用，实验过程中所要用的移液枪、实验台均用酒精擦拭，离心管、枪头均无RNA酶。
[0020](1
‑
2)取850μl CTAB缓冲液到2ml离心管中，放入65℃水浴锅预热。
[0021](1
‑
3)称取0.2g材料于加入液氮的研钵中充分研磨，待材料呈粉末状即可转入(1
‑
2)中预热的离心管中，加入材料前先加入25μlβ
‑
巯基乙醇。
[0022](1
‑
4)立即涡旋30s混匀，65℃水浴6min。
[0023](1
‑
5)加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)，剧烈震荡，开盖放气，涡旋30s，室温11000rpm离心15min。
[0024](1
‑
6)吸取上清于新2ml离心管中，加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)再抽提一次，涡旋30s，室温11000rpm离心15min。
[0025](1
‑
7)吸取上清于新1.5ml离心管中，加入1/3体积8mol/l LiCl，颠倒混匀，在4℃下沉淀10
‑
12h，不要超过16h。
[0026](1
‑
8)4℃下，11000rpm离心30min，弃上清，用75％乙醇500μl洗涤沉淀两次，弃去液体，风干。
[0027](1
‑
9)加入30
‑
40μl RNase
‑
free水溶解沉淀。
[0028](1
‑
10)取2μl RNA样品用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，取2μl RNA样品用SimpliNano微量分光光度计测定样品的浓度与纯度，剩余RNA样品于
‑
80℃保存备用，保存时间不要超过一周。
[0029]进一步地，步骤(2
‑
2)中的扩增引物包括AcKNOX1
‑
F和AcKNOX1
‑
R的序列，序列分别如序列表中的SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示。
[0030]本专利技术的另一目的在于提供一种菠萝AcKNOX1基因表达载体，利用菠本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种菠萝AcKNOX1基因，其特征在于：该基因序列具有序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。2.一种菠萝AcKNOX1基因的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以菠萝为材料，利用CTAB法提取总RNA；(2)AcKNOX1基因的克隆；(2
‑
1)利用Transgene公司的Trans
‑
Uni One
‑
Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix Kit将RNA反转录为cDNA，作为PCR模板备用；(2
‑
2)设计全长cDNA扩增引物；(2
‑
3)根据引物的Tm值进行PCR条件的优化后，进行PCR扩增，并将获得的产物连接到大肠杆菌，经PCR和酶切鉴定后进行序列测定。3.根据权利要求2所述的菠萝AcKNOX1基因的克隆方法，其特征在于，步骤(1)总RNA的提取具体如下：(1
‑
1)准备工作：将研钵提前放入烘箱180℃烘4h后冷却至室温待用，实验过程中所要用的移液枪、实验台均用酒精擦拭，离心管、枪头均无RNA酶；(1
‑
2)取850μl CTAB缓冲液到2ml离心管中，放入65℃水浴锅预热；(1
‑
3)称取0.2g材料于加入液氮的研钵中充分研磨，待材料呈粉末状即可转入(1
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2)中预热的离心管中，加入材料前先加入25μlβ
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巯基乙醇；(1
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4)立即涡旋30s混匀，65℃水浴6min；(1
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5)加入等体积氯仿/异戊醇，剧烈震荡，开盖放气，涡旋30s，室温11000rpm离心15min；(1
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6)吸取上清于新2ml离心管中，加入等体积氯仿/异戊醇，再抽提一次，涡旋30s，室温11000rpm离心15min；(1
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7)吸取上清于新1.5ml离心管中，加入1/3体积8mol/l LiCl，颠倒混匀，在4℃下沉淀10
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12h，不要超过16h；(1
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【专利技术属性】
技术研发人员：荆永琳，徐立，李志英，王小冰，孟春阳，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，
类型：发明
国别省市：