一个簇毛麦全生育期广谱抗白粉病基因Pm5V及其应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程领域，公开了一个簇毛麦全生育期广谱抗白粉病基因Pm5V及其应用。Pm5V基因的CDS序列为SEQ ID NO.1及其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。该基因来自簇毛麦(Dasypyrum villosum)。克隆Pm5V基因，扩增引物序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6。本发明专利技术所述的具有簇毛麦全生育期广谱抗白粉病的基因Pm5V在抵抗小白粉病，提高小麦抗病性，且携带Pm5V基因的T5DL.5VS易位系农艺性状优良，对产量等重要性状没有负向效应，育种利用价值高。育种利用价值高。育种利用价值高。

A broad-spectrum powdery mildew resistance gene pm5v in the whole growth period of tufted wheat and its application

【技术实现步骤摘要】
一个簇毛麦全生育期广谱抗白粉病基因Pm5V及其应用


[0001]本专利技术属于基因工程领域，公开了一个簇毛麦全生育期广谱抗白粉病基因Pm5V及其应用。

技术介绍

[0002]小麦是一种世界性粮食作物，其适应性强、分布范围广，为超过三分之一的人类提供主要能量来源，小麦的产量和品质直接关系到全人类的食物安全。由小麦白粉菌(Blumeria graminis f.sp tritici)引起的小麦白粉病是小麦主要的病害之一。它属于专化寄生，可以在整个生育期侵染小麦的叶部、茎秆、穗部等，其中主要危害小麦叶片，严重时影响小麦正常的光合作用，从而影响其正常的生长，降低产量。近十年，我国小麦白粉病发病面积每年在667万hm2以上，造成年均损失产量约1000万吨，严重威胁我国小麦的安全生产，因此小麦白粉病的防治越来越受到人们的关注。
[0003]抗病基因的挖掘和抗病品种的培育是防治小麦白粉病最可持续的策略。然而单一抗源抗性的频繁丧失，使育种工作总是在被动地追赶病原菌小种的变化，严重制约着小麦产量和品质水平的进一步提高。因此，需要发掘新类型抗源，提高抗病基因的遗传多样性，有利于保持小麦品种抗白粉病的持久性。
[0004]全生育期广谱抗白粉病基因Pm5V定位于簇毛麦01I140染色体臂5VS，高抗我国目前所有白粉菌生理小种(范亚丽，2020)。通过创制小麦
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簇毛麦T5DL.5VS易位系，已将Pm5V基因导入普通小麦遗传背景，创制了不同遗传背景的抗病新品系。利用不同T5DL.5VS易位系构建遗传分离群体，对Pm5V基因进行了精细定位分析(穆换清，2021)。进一步对携带Pm5V基因的5VS染色体臂分拣测序，结合定位区间、基因沉默等功能分析，实现了Pm5V基因的图位克隆。携带Pm5V基因的T5DL.5VS易位系农艺性状优良，对产量等重要性状没有负向效应，育种利用价值高，并开发了易于鉴定Pm5V基因的分子标记，将加快该基因的育种利用。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是公开一个簇毛麦全生育期广谱抗白粉病基因Pm5V及其育种利用方法。
[0006]本专利技术所述的Pm5V基因的DNA序列位于簇毛麦5VS染色体上，DNA序列全长是3804bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码1267个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0007]本专利技术所述的Pm5V基因，扩增引物序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6。
[0008]含有所述的基因Pm5V的重组表达载体。
[0009]所述的基因Pm5V在培育抗白粉病小麦品种中的应用。
[0010]作为本专利技术的一种优选，将其携带Pm5V基因的小麦
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簇毛麦T5DL.5VS易位系与不携带Pm5V基因的小麦品种杂交，通过分子标记辅助选择，培育携带Pm5V基因的小麦新品种，
提高小麦的白粉病抗性；所述的分子标记辅助选择使用SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物。
[0011]作为本专利技术的另一种优选，将所述的基因Pm5V通过基因工程手段导入易感白粉病小麦品种中，以提高其对白粉病的抗性。
[0012]所述的重组表达载体在培育抗白粉病小麦品种中的应用。
[0013]一种基因Pm5V的分子标记引物，由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物P1和P2、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6组成。
[0014]所述的分子标记引物在小麦抗白粉病育种中的应用。
[0015]有益效果
[0016]本专利技术图位克隆得到了一个簇毛麦全生育期广谱抗白粉病基因Pm5V，高抗我国目前所有白粉菌生理小种(图1)。Pm5V用于抗病育种，能够提高小麦品种的白粉病抗性(图10)。携带Pm5V基因的T5DL.5VS易位染色体在小麦背景中不与5DS发生交换重组，Pm5V基因与5VS上的其它优异基因呈单一位点连锁遗传，易位染色体对产量等重要性状没有负向效应，育种利用效率高(图8)。所开发的Pm5V基因的分子标记，易于分子标记辅助选择，将加快该基因的育种利用(图3)。
附图说明
[0017]图1用来自不同小麦产区的24个Bgt菌株，对携带Pm5V基因材料TF5V
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11进行抗谱分析，发现Pm5V对目前我国白粉菌生理小种均具有抗性。注；白粉病反应型采用0
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4级标准，0：免疫；0；：过敏性坏死；1：高度抗性；2：中度抗性；3：中度感病；4：高度感病
[0018]图2含有Pm5V基因的高代品系与其轮回亲本NAU0686的主要农艺性状分析，发现携带Pm5V基因的T5DL.5VS易位染色体对主要农艺性状没有显著负向效应。
[0019]图3 Pm5V基因的PCR克隆。该基因分2段克隆，第一段标记P1/P2的PCR产物经凝胶电泳后,条带大小为2478bp；第二段标记P3/P4的PCR产物经凝胶电泳后,条带大小为2223bp。
[0020]图4利用Q
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PCR分析Pm5V等位基因在抗白粉病材料TF5V
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11和感白粉病材料TF5V
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2中的差异表达，发现仅抗病材料TF5V
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11中Pm5V的等位基因受白粉菌诱导表达。0小时：Pm5V在未诱导样品中的相对表达量；8、12、24、36、72小时：Pm5V在白粉菌诱导样品中的相对表达量。
[0021]图5利用大麦条纹病毒(VIGS)对Pm5V基因沉默验证，通过对第4片有表型的叶片进行白粉病鉴定，发现Pm5V基因表达量降低后，叶片出现了白粉菌孢子，表明Pm5V基因与白粉病抗性相关。对照分别是1：BSMV:PDS、2：未接种任何病毒的TF5V
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11、3：BSMV:γ空，以及3组处理4、5、6：BSMV:γ
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Pm5V。
[0022]图6 VIGS沉默Pm5V基因效率检测。接种病毒后分别取第4片中出现条纹表型的叶片提取RNA，反转cDNA后，利用qPCR进行基因沉默效率的检测。对照CK是BSMV:γ空，1、2、3、4、5是五个独立单株接种重组病毒BSMV:γ
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Pm5V的沉默效率。黑色柱状图表示沉默靶点位于Pm5V CC结构域的5个单株，灰色柱状图表示沉默靶点位于Pm5V NBS结构域的5个单株。接种后Pm5V的表达量均显著降低，表明沉默效率较高。
[0023]图7 Pm5V过表达转基因分析。利用过表达启动子ubiquitin与Pm5V全长基因连接，
构建农杆菌转基因载体，利用农杆菌侵染转感白粉病品种Fielder，对T1代5株阳性单株利用白粉菌生理小种E26进行接种鉴定，发现均达到了高抗水平，表明Pm5V对白粉病抗性的有效性。
[0024]图8携带Pm5V基因材料的GISH/FISH鉴定。利用簇毛麦基因组探针、oligo探针pAs1
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.具有簇毛麦全生育期广谱抗白粉病基因Pm5V，其序列如SEQ ID NO.1所示。2.权利要求1所述的基因Pm5V编码的蛋白质，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2。3.权利要求1所述的基因Pm5V克隆序列引物为SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6。4.含有权利要求1所述的基因Pm5V的重组表达载体。5.权利要求1所述的基因Pm5V在培育抗白粉病小麦品种中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于将其携带Pm5V基因的小麦
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簇毛麦T5DL.5VS易位系与不携带Pm5V基因的小麦品种杂交，通过分子标...

【专利技术属性】
技术研发人员：张瑞奇，卢春甜，范亚丽，穆换清，邢莉萍，曹爱忠，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：