大豆氮营养高效基因GmNN1及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种大豆氮营养高效基因GmNN1及其应用。所述GmNN1基因从氮高效大豆材料中分离鉴定得到，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码的蛋白序列如SEQ ID NO:2所示，其启动子区域存在43bp的插入/缺失变异，导致其表达量明显不同。近等基因系及转基因敲除/过表达GmNN1试验证明，GmNN1通过调控大豆结瘤进而提高了大豆氮效率。嫁接实验证明，GmNN1蛋白从地上部移动到根系调控大豆根瘤的形成，进而提高了生物固氮能力，最终促进了大豆生长和植株氮含量。本发明专利技术为氮高效及高效固氮的大豆分子育种或遗传改良提供基因资源，对发展减肥增效的绿色可持续农业具有重要的指导和实践意义。意义。

Soybean nitrogen nutrition efficient gene gmnn1 and its application

【技术实现步骤摘要】
大豆氮营养高效基因GmNN1及其应用


[0001]本专利技术属于植物基因工程领域，具体涉及一种利用正向遗传和图位克隆技术分离鉴定到的大豆氮营养高效基因GmNN1及其应用。

技术介绍

[0002]大豆是粮、油、饲兼用作物，在国民经济中发挥重要作用。氮是植物生长发育所必需的大量营养元素，提高大豆氮营养效率对生态农业及粮食安全意义重大。氮营养效率是由多基因控制的数量性状，植物对氮素有效性的响应能力主要取决于基因型及其与外界氮素的互作，解析氮效率的遗传机制，对培育氮高效大豆新品种具有指导意义。
[0003]对于大豆而言，获取氮的方式主要包括：根系吸收和共生固氮两条途径。其中，共生固氮是豆科植物特有的高效固氮模式，通过固氮器官根瘤的形成，为宿主提供了60%以上的氮素，是天然的氮肥工厂。因此，充分挖掘大豆的生物固氮机制，提高结瘤和固氮效率，不仅能够降低农业投入，而且还能促进农业可持续绿色发展。
[0004]氮高效的遗传机制在水稻、玉米等作物中取得了较大进展，然而在大豆中的研究相对较少。虽然根瘤固氮相关性状的主效QTLs及相关基因被大量报道，但是多集中于根瘤器官的发育、衰老及固氮作用，迄今为止，关于氮营养基因通过调控共生固氮，协同提高氮效率的研究报道较少，需要科学家们挖掘更多的基因资源解析氮营养与结瘤之间相互作用的机制。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种大豆氮营养高效基因GmNN1及其应用。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术首先提供了一种大豆氮营养高效基因GmNN1，所述大豆氮营养高效基因GmNN1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0007]进一步的，上述大豆氮营养高效基因GmNN1编码的蛋白序列如SEQ ID NO:2所示。
[0008]进一步的，上述大豆氮营养高效基因GmNN1为通过图位克隆方法从氮高效大豆材料中分离鉴定得到。
[0009]本专利技术还提供了上述的大豆氮营养高效基因GmNN1在促进大豆结瘤固氮能力方面的应用。
[0010]本专利技术还提供了一种增强大豆结瘤固氮能力的方法，将上述的大豆氮营养高效基因GmNN1在大豆中过表达。
[0011]本专利技术还提供了一种大豆氮营养高效基因GmNN1的启动子，所述启动子为SEQ ID NO:4所示的DNA序列。
[0012]本专利技术还提供了一种含有上述的启动子的重组载体。
[0013]本专利技术还提供了上述启动子在启动目的基因在大豆中表达中的应用；或，上述启动子在培育氮营养高效大豆材料中的应用；
或，上述启动子在大豆遗传改良中的应用。
[0014]本专利技术进一步利用GmNN1近等基因系实验证明叶片SPDA值及氮浓度在GmNN1高表达的近等基因系（NIL
‑
GmNN1）中显著高于GmNN1低表达的近等基因系（NIL
‑
Gmnn1）。与野生型大豆相比，过量表达GmNN1的转基因大豆显著增加了氮营养，叶片浓绿，SPDA值及氮浓度显著增加；而敲除GmNN1突变体植株则叶片变黄，SPDA值及氮浓度显著下降。同时，GmNN1调控大豆结瘤，与野生型大豆相比，NIL
‑
GmNN1及过表达植株的根瘤数目和根瘤重量显著增加，而NIL
‑
Gmnn1及敲除GmNN1突变体大豆结瘤受到抑制。表达模式分析发现，GmNN1主要在叶片中表达，其蛋白从地上部移动到根系促进根瘤的形成。最后，过表达GmNN1显著促进大豆在低氮条件下的生长、提高了生物量，增加了大豆氮含量，敲除GmNN1突变体植株则出现相反的结果。
[0015]本专利技术的有益之处在于：本专利技术通过大田筛选获得了两个氮营养效率存在显著差异的大豆材料，进一步图位克隆到一个氮高效基因GmNN1，明确了GmNN1控制大豆氮营养的遗传变，验证了其生物学功能。此项研究对促进包括大豆在内的豆科作物氮效率具有重要意义；研究结果为高产高效及低氮土壤广适性的大豆遗传改良提供了基因资源，同时对发展减肥增效可持续生态农业具有重要的指导和实践意义。此外，研究内容丰富了大豆氮高效的遗传与分子调控机制的研究。
附图说明
[0016]图1为ND (氮低效) 和NS (氮高效)大豆材料及GmNN1近等基因系的氮营养差异分析；图中，A：ND (氮低效) 和NS (氮高效) 大豆材料的田间表型；B：ND和NS两种材料的SPAD值；C：ND和NS两种材料的叶片氮浓度；D：GmNN1近等基因系的氮营养表型；E: GmNN1近等基因系的叶片SPAD值。
[0017]图2为GmNN1的图位克隆。
[0018]图3为主效基因GmNN1的遗传变异及其启动子驱动GUS的表达差异分析；图中，A：GmNN1在ND和NS材料中的序列差异；B：烟草GUS染色；C：GUS表达量；D：GUS酶活性分析。
[0019]图4为敲除突变体类型；图中，A：一个碱基插入；B：一个碱基缺失。
[0020]图5为敲除及过表达GmNN1对大豆氮营养的影响；图中，A：叶片表型分析；B：SPAD值；C：不同材料间的叶片氮浓度比较分析。
[0021]图6为GmNN1对大豆结瘤的影响；图中，A：敲除及过表达GmNN1的根瘤表型；B：侧根数目；C：根瘤重量；D：GmNN1近等基因系的根瘤表型；E：GmNN1近等基因系间根瘤数目比较分析；F：GmNN1近等基因系间根瘤重量比较分析。
[0022]图7为GmNN1的表达模式分析；图8为GmNN1对结瘤的调控依赖于地上部GmNN1蛋白的移动；图中，A：不同嫁接模式的结瘤表型；B：根瘤数目；C：GFP的表达量分析；D：蛋白印迹分析GmNN1的移动性。
[0023]图9为敲除及过表达GmNN1对大豆生长及氮含量的影响；图中，A：植株干重；B：植株氮含量。
具体实施方式
[0024]下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0025]实施例1 GmNN1基因的图位克隆1. 近等基因系的构建本研究用于定位氮效率的母本NS和父本ND是从JD12和华春6号群体里筛出来的中间材料（图1A）。以SPAD值及氮浓度为指标，认为ND为氮低效型，而NS为氮高效型。ND和NS的生育期相近，而叶片颜色明显不同，ND叶片明显黄于NS材料。因此，本研究于鼓粒期测定了ND和NS的叶片SPAD值（图1B）及氮浓度（图1C），结果发现ND的叶片SPAD值及氮浓度分别较NS降低了34.9%和62.9%。
[0026]为了进一步克隆控制氮营养效率的主效基因，对ND和NS进行了全基因组重测序（whole genome sequencing，WGS），并通过杂交方式，以NS材料为母本， ND材料为父本杂交得到F1，然后以F1为基础，利用 F1自交得本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种大豆氮营养高效基因GmNN1，其特征在于：所述大豆氮营养高效基因GmNN1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。2.根据权利要求1所述的大豆氮营养高效基因GmNN1，其特征在于：所述大豆氮营养高效基因GmNN1编码的蛋白序列如SEQ ID NO:2所示。3.根据权利要求1所述的大豆氮营养高效基因GmNN1，其特征在于：所述大豆氮营养高效基因GmNN1为通过图位克隆方法从氮高效大豆材料中分离鉴定得到。4.如权利要求1所述的大豆氮营养高效基因GmNN1在...

【专利技术属性】
技术研发人员：李欣欣，廖红，钟永嘉，程玲，周慧文，马念念，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：