一种基于上转换纳米生物传感体系对丙烯酰胺含量的检测方法技术

本发明专利技术属于食品安全检测技术领域，具体涉及一种基于上转换和银纳米簇特异性体系检测丙烯酰胺含量的方法。步骤为：首先制备核壳结构上转换纳米材料，在核壳上转换纳米材料表面修饰二氧化硅和氨基基团；将表面改性的上转换纳米材料和DNA1结合，再加入适配体和DNA2进行结合得到特异性检测体系；加入不同浓度丙烯酰胺溶液后除去脱落的适配体和DNA2链；再次加入硝酸银和硼氢化钠以残留的DNA2为模板合成银纳米簇；最后测定不同丙烯酰胺浓度体系中荧光强度信号作为纵坐标，以丙烯酰胺浓度的对数值为横坐标建立标准曲线；本发明专利技术实现食品中丙烯酰胺的高特异性、灵敏性检测，具有较宽的浓度检测范围和较低的检测限，应用前景良好。应用前景良好。应用前景良好。

A detection method of acrylamide content based on up conversion nano biosensor system

【技术实现步骤摘要】
一种基于上转换纳米生物传感体系对丙烯酰胺含量的检测方法


[0001]本专利技术属于食品安全检测
，具体涉及一种基于上转换和银纳米簇特异性体系检测丙烯酰胺含量的方法。

技术介绍

[0002]丙烯酰胺一种广泛存在于热加工食品中的一种物质，主要是在高温低湿度条件下，通过天冬酰胺和还原糖之间的美拉德反应产生。人体的许多器官都可以吸收和积累丙烯酰胺，并与血红蛋白、DNA或酶结合造成伤害。已经有研究证明，丙烯酰胺具有遗传毒性、神经毒性、生殖毒性和潜在的致癌作用。世界卫生组织规定每日饮用水中丙烯酰胺限量为0.5μg/L。
[0003]传统的丙烯酰胺检测方法，如气相色谱法和高效液相色谱法，虽然具有较高的准确性和稳定性，但是其仪器设备昂贵、操作步骤繁琐，不能满足丙烯酰胺含量的快速检测。本专利技术提出了一种快速准确的丙烯酰胺含量检测方法，克服传统方法高成本、速度慢的的缺陷，提高汞检测的灵敏度和准确性。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于解决现有技术存在的问题，如检测时间长、仪器成本高等缺陷，提供了一种基于上转换和银纳米簇，借助DNA自组装特性的特异性体系用于食品中丙烯酰胺定量的荧光纳米传感器，从而实现食品中丙烯酰胺的快速、灵敏、准确的检测。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
[0006]本专利技术提供一种丙烯酰胺的检测方法，包括以下步骤：
[0007]步骤一，核心上转换纳米材料的制备：将六水氯化钆、六水氯化镱、六水氯化铥加入到甲醇A中超声溶解，再加入油酸和1
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十八烯，形成混合溶液；在氩气保护条件下进行第一次加热搅拌反应，反应后冷却至室温，得到冷却液；将氟化铵、氢氧化钠和甲醇B混合后，加入冷却液中，进行第一次水浴反应，反应后升温进行第二次水浴反应；水浴反应后在氩气保护条件下进行第二次加热搅拌反应，反应后冷却至室温，得到反应产物；经清洗、真空干燥得到核心上转换纳米材料；
[0008]步骤二，核壳上转换纳米材料的制备：将六水氯化钇加入到甲醇C中超声溶解，转移到油酸和1
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十八烯的混合液中；在氩气的保护下，进行第一次加热搅拌反应，反应后冷却至室温，得到冷却液；
[0009]将步骤一得到的核心上转换纳米溶于环己烷中，再和氟化铵、氢氧化钠以及甲醇D混合后，加入冷却液中，进行第一次水浴反应，反应后升温进行第二次水浴反应；水浴反应后在氩气保护下，第二次加热搅拌反应，冷却至室温，得到反应产物；对反应产物清洗，真空干燥得到核壳上转换纳米材料；
[0010]步骤三，核壳上转换纳米材料的功能化修饰：将步骤二得到的核壳上转换纳米材
料加入到盐酸中，超声分散；清洗后分散于乙醇中，加入去离子水与氨水，在一定温度条件下进行第一次搅拌反应；反应后再加入正硅酸四乙脂进行第二次搅拌反应；最后加入3
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氨丙基三乙氧基硅烷，进行第三次搅拌反应，得到反应产物；经清洗、真空干燥，得到氨基功能化核壳上转换纳米材料；
[0011]步骤四，适配体互补链1(DNA1)功能化的核壳上转换纳米材料：将步骤三得到的氨基功能化核壳上转换纳米材料溶解在磷酸盐缓冲液A中；然后加入戊二醛，搅拌反应；用磷酸盐缓冲溶液离心清洗后溶于磷酸盐缓冲溶液B，加入亲和素进行第一次孵育反应；最后加入适配体互补链1(DNA1)进行第二次孵育得到DNA1链功能化的核壳上转换纳米材料；
[0012]步骤五，特异性检测体系的建立：将步骤四得到的DNA1功能化的核壳上转换纳米材料溶解于磷酸盐缓冲液中，加入丙烯酰胺适配体和适配体互补链2(DNA2)进行孵育，得到丙烯酰胺的特异性检测体系；
[0013]步骤六，丙烯酰胺检测标准曲线的建立：在步骤五中制备得丙烯酰胺的特异性检测体系中分别加入不同浓度的丙烯酰胺标准溶液，得到不同浓度的检测液，一种浓度的丙烯酰胺标准溶液对应一份特异性检测体系，两者为一一对应关系；再对不同浓度检测液进行离心得到沉淀物，使用磷酸盐缓冲液对沉淀物进行清洗，清洗后的沉淀物再次分散于磷酸盐缓冲液C中，加入硝酸银溶液第一次反应后，加入硼氢化钠溶液进行第二次反应；反应后测定加入不同浓度的丙烯酰胺溶液的特异性检测体系的荧光强度信号特征值，记为Y，建立丙烯酰胺浓度(c)与荧光强度信号特征值的关系，即得到丙烯酰胺检测标准曲线；
[0014]步骤七，食品样本中丙烯酰胺含量的检测：将食品样本粉碎，加入去离子水震荡并超声处理；然后将上清液通过固相萃取柱净化，得到净化后的上清液加入到丙烯酰胺的特异性检测体系中，测定特异性检测体系的荧光强度信号特征值，通过步骤六所构建的丙烯酰胺检测标准曲线，计算出食品样本中丙烯酰胺的含量。
[0015]优选的，步骤一中，所述六水氯化钆、六水氯化镱、六水氯化铥、甲醇A的用量比为0.07434g：0.07593g：0.0015g：4mL；所述超声溶解的时间为10min；所述第一次加热搅拌反应，温度为150～170℃，时间为30min；所述第二次加热搅拌反应的温度为290～310℃，时间为1h；所述甲醇A、油酸和1
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十八烯的体积比为4mL：4mL：7mL；所述甲醇A、氟化铵、氢氧化钠、甲醇B的用量比为4mL：0.06g：0.04g：4mL；所述第一次水浴反应的温度为40～60℃，水浴反应40min，第二次水浴反应的温度为100℃，水浴反应10min。
[0016]优选的，步骤二中，所述六水氯化钇和甲醇C的用量比为0.1214g：4mL；所述超声溶解的时间为10～15min；所述第一次加热搅拌反应的温度为150～170℃，时间为30min；所述第二次加热搅拌反应的温度为290～310℃，时间为1h；所述甲醇C、油酸、1
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十八烯、核心上转换纳米材料、环己烷、氟化铵、氢氧化钠、甲醇D的用量比为4mL：4mL：7mL：50mg：5mL：0.06g：0.04g：4mL；所述第一次水浴反应的温度为40～60℃，水浴反应时间为40min，第二次水浴反应的温度为60～80℃，水浴反应时间为30min。
[0017]优选的，步骤三中，所述核壳上转换纳米材料、盐酸、乙醇、去离子水、氨水、正硅酸四乙脂、3
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氨丙基三乙氧基硅烷的用量比为20mg：1mL：60mL：10mL：2.5mL：0.01
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0.05mL：0.03～0.08mL；所述盐酸浓度为0.1M；所述超声分散时间为10～15min；所述氨水的体积浓度为25％；所述第一次搅拌的温度为65℃，搅拌时间为10min；所述第二次搅拌的温度为65℃，搅拌时间2～6h；所述第三次搅拌的温度为65℃，搅拌时间为1～3h。
[0018]优选的，步骤四中，所述氨基功能化核壳上转换纳米材料、磷酸盐缓冲液A、戊二醛、磷酸盐缓冲溶液B、亲和素、DNA1的用量比为20mg：10mL：2.5mL：10mL：0.1mL：0.1mL；所述搅拌反应时间为2h；所述磷酸盐缓冲液A和磷酸盐缓冲液B浓度均为10mM，pH均为7.4；所述戊二醛的体积浓本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于上转换纳米生物传感体系对丙烯酰胺含量的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一，将六水氯化钆、六水氯化镱、六水氯化铥加入到甲醇A中超声溶解，再加入油酸和1
‑
十八烯，形成混合溶液；在氩气保护条件下进行第一次加热搅拌反应，反应后冷却至室温，得到冷却液；将氟化铵、氢氧化钠和甲醇B混合后，加入冷却液中，进行第一次水浴反应，反应后升温进行第二次水浴反应；水浴反应后在氩气保护条件下进行第二次加热搅拌反应，反应后冷却至室温，得到反应产物；经清洗、真空干燥得到核心上转换纳米材料；步骤二，将六水氯化钇加入到甲醇C中超声溶解，转移到油酸和1
‑
十八烯的混合液中；在氩气的保护下，进行第一次加热搅拌反应，反应后冷却至室温，得到冷却液；将步骤一得到的核心上转换纳米溶于环己烷中，再和氟化铵、氢氧化钠以及甲醇D混合后，加入冷却液中，进行第一次水浴反应，反应后升温进行第二次水浴反应；水浴反应后在氩气保护下，第二次加热搅拌反应，冷却至室温，得到反应产物；对反应产物清洗，真空干燥得到核壳上转换纳米材料；步骤三，将步骤二得到的核壳上转换纳米材料加入到盐酸中，超声分散；清洗后分散于乙醇中，加入去离子水与氨水，在一定温度条件下进行第一次搅拌反应；反应后再加入正硅酸四乙脂进行第二次搅拌反应；最后加入3
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氨丙基三乙氧基硅烷，进行第三次搅拌反应，得到反应产物；经清洗、真空干燥，得到氨基功能化核壳上转换纳米材料；步骤四，将步骤三得到的氨基功能化核壳上转换纳米材料溶解在磷酸盐缓冲液A中；然后加入戊二醛，搅拌反应；用磷酸盐缓冲溶液离心清洗后溶于磷酸盐缓冲溶液B，加入亲和素进行第一次孵育反应；最后加入适配体互补链1进行第二次孵育得到DNA1链功能化的核壳上转换纳米材料；步骤五，特异性检测体系的建立：将步骤四得到的DNA1功能化的核壳上转换纳米材料溶解于磷酸盐缓冲液中，加入丙烯酰胺适配体和适配体互补链2进行孵育，得到丙烯酰胺的特异性检测体系；步骤六，丙烯酰胺检测标准曲线的建立：在步骤五中制备得丙烯酰胺的特异性检测体系中分别加入不同浓度的丙烯酰胺标准溶液，得到不同浓度的检测液，一种浓度的丙烯酰胺标准溶液对应一份特异性检测体系，两者为一一对应关系；再对不同浓度检测液进行离心得到沉淀物，使用磷酸盐缓冲液对沉淀物进行清洗，清洗后的沉淀物再次分散于磷酸盐缓冲液C中，加入硝酸银溶液第一次反应后，加入硼氢化钠溶液进行第二次反应；反应后测定加入不同浓度的丙烯酰胺溶液的特异性检测体系的荧光强度信号特征值，记为Y；建立丙烯酰胺浓度与荧光强度信号特征值的关系，即得到丙烯酰胺检测标准曲线；步骤七，食品样本中丙烯酰胺含量的检测：将食品样本粉碎，加入去离子水震荡并超声处理；然后将上清液通过固相萃取柱净化，加入到特异性检测体系中，测定特异性检测体系的荧光强度信号特征值，通过步骤六所构建的丙烯酰胺检测标准曲线，计算出食品样本中丙烯酰胺的含量。2.根据权利要求1所述的一种基于上转换纳米生物传感体系对丙烯酰胺含量的检测方法，其特征在于，步骤一中，所述六水氯化钆、六水氯化镱、六水氯化铥、甲醇A的用量比为0.07434g：0.07593g：0.0015g：4mL；所述超声溶解的时间为10min；所述第一次加热搅拌反应，温度为150
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170℃，时间为30min；所述第二次加热搅拌反应的温度为290～310℃，时间
为1h；所述甲醇A、油酸和1
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十八烯的体积比为4mL：4mL：7mL；所述甲醇A、氟化铵、氢氧化钠、甲醇B的用量比为4mL：0.06g：0.04g：4mL；所述第一次水浴反应的温度为40
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60℃，水浴反应40min，第二次水浴反应的温度为100℃，水浴反应10min。3.根据权利要求1所述的一种基于上转换纳米生物传感体系对丙烯酰胺含量的检测方法，其特征在于，步骤二中，所述六水氯化钇和甲醇C的用量比为0.1214g：4mL；所述超声溶解的时间为10～15min；所述第一次加热搅拌反应的温度为150
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170℃，时间为30min；所述第二次加热搅拌反应的温度为290
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310℃，时间为1h；所述甲醇C、油酸、1
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十八烯、核心上转换纳米材料、环己烷、氟化铵、氢氧化钠、甲醇D的用量比为4mL：4mL：7mL：50mg：5mL：0.06g：0.04g：4mL；所述第一次水浴反应的温度为40
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60℃，水浴反应时间为40min，第二次水浴反应的温度为60
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80℃，水浴反应时间为30min...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈全胜，荣雅文，欧阳琴，张运莲，丁小丹，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：