快速制备和纯化枯草芽孢杆菌芽孢的方法技术

本发明专利技术公开了一种快速制备和纯化枯草芽孢杆菌芽孢的方法，配备质量分数为65

【技术实现步骤摘要】
快速制备和纯化枯草芽孢杆菌芽孢的方法


[0001]本专利技术属于微生物芽孢制备领域，具体涉及一种快速制备和纯化枯草芽孢杆菌芽孢的方法。

技术介绍

[0002]芽孢是芽孢杆菌属或梭菌属细菌在营养匮乏条件下形成的休眠体，独特结构赋予了芽孢极强的抗性（抗高温、高压、辐射等）而很难被杀灭。当外界环境变化适合微生物生长时，芽孢通过萌发过程重新变成具有正常新陈代谢功能的营养体细胞，进而引起食品腐败变质甚至一些食源性疾病。因此，芽孢的存在一直是食品安全的重要威胁，而目前食品产业仍然没有很好的杀灭芽孢的方法，关键的制约问题是，缺乏快速制备高纯度的芽孢的方法，因为拥有高纯度芽孢是开展芽孢研究的首要条件，也是本专利技术的主要内容。
[0003]枯草芽孢杆菌因遗传稳定性强、利于分子实验的实施而成为研究的模式菌株。现阶段，枯草芽孢杆菌芽孢的制备主要包括两种方法：（1）将在LB液体培养基活化后的枯草芽孢杆菌菌液接种至含有Mg
2+
的营养琼脂培养基上培养7天以上得到芽孢。此种方法需要培养7天以上才能形成芽孢，水洗得到的芽孢悬液中含有未萌发的芽孢、萌发的芽孢、细菌营养体三种不同形态的微生物，同时芽孢纯度较低（≤60%）。（2）将活化后得到的枯草芽孢杆菌菌液转接到2
ⅹ
SG固体培养基上培养4～6天（36～38℃）得到芽孢。此种方法所用时间有了一定的缩短，且芽孢的纯度（约80%）也得到了提高。但4
‑
6天制备芽孢的时间仍然较长，水洗后得到的芽孢溶液仍含有芽孢、萌发的芽孢、细菌营养体三种不同形态的微生物。随后，利用湿热处理（80℃，20min）的方法将上述方法制备的纯度不高（≤80%）的芽孢悬液（粗芽孢悬液）中萌发芽孢和细菌营养体杀灭。
[0004]如今，很多学者利用上述方法制备的芽孢进行后续的芽孢抗性和生理生化特性的研究。但此种方法忽略了湿热处理后萌发芽孢和细菌营养体对芽孢的影响。已有报道证明细菌营养体中细胞壁裂解产物能诱导芽孢萌发。因此，为了增加芽孢研究的严谨性和准确性，研究人员需要使用纯度极高的芽孢（≥98%）。芽孢研究领域国际著名专家Setlow Peter教授在2018年专门发表文章说明使用高纯度芽孢研究的必要性，需要对制备的粗芽孢悬液进行进一步的分离纯化。现阶段，人们对制备的芽孢粗悬液分离纯化方法主要有：（1）通过振荡和离心分层沉淀后，再选择性将沉淀层中的细菌菌体重新悬浮于蒸馏水中而保持芽孢沉淀层完整，从而达到对芽孢进行分离纯化的目的。此方法通常需要对混悬液进行三到五次离心，耗时四到六小时，不能将萌发的芽孢进行分离且芽孢得率较低；（2）使用18～25％质量百分含量的碘海醇溶液悬浮粗芽孢悬液，振荡后再转入45～60％质量百分含量的碘海醇溶液，3～5℃下8000～12000rpm离心10～20min，去除上层悬浮液，收集沉淀并用无菌水洗涤3～6次，于8000～12000rpm离心6～10min，收集得到芽孢。此种方法只能将芽孢和细菌营养体分开，而不能将萌发芽孢有效的分离，同时碘海醇价格十分昂贵，大大增加了纯化芽孢所用的成本。
[0005]有鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0006]针对现有技术中存在的问题，本专利技术提供一种快速制备和纯化枯草芽孢杆菌芽孢的方法，本专利技术专利技术快速制备芽孢的方法（≤24 h），同时使用价格便宜的蔗糖对粗芽孢悬液进行快速分离纯化（≤ 2h），制备得到高纯度芽孢（≥98%）。
[0007]为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：一种快速制备和纯化枯草芽孢杆菌芽孢的方法；包括如下步骤：（一）芽孢的制备：a、将活化三代后的B. subtilis 168菌株在LB平板上划线过夜培养至长出单菌落，挑选新鲜的单菌落转接到20 mL LB液体培养基中200 rpm、37℃过夜培养至OD
600 为1.2
‑
1.5；b、将步骤（2）中细菌悬液转接到促芽孢生长培养基DSM中培养20
‑
24h；c、离心收集步骤b中芽孢悬液，得到未纯化芽孢悬液，用相差显微镜镜检芽孢形态，产芽孢率≥85%；（二）芽孢纯化：（1）配备质量分数为65
‑
75%、80
‑
85%、90
‑
95%的蔗糖溶液，分别记为A、B、C溶液；（2）取20
‑
30mL步骤c中未纯化芽孢悬液离心，用4
‑
6 mL A溶液将芽孢重悬，使得芽孢悬液OD
600
≥ 20，置于冰上10
‑
30 min；（3）用一次性吸管吸取15
‑
25 mL C溶液加入到50 mL无菌离心管中，防止溶液碰到管壁；（4）用一次性吸管吸取4
‑
6 mL B溶液，逐滴、缓慢加入到C溶液上表面；（5）将含有芽孢悬液的A溶液逐滴、缓慢加入到B溶液上表面，加入完后芽孢悬液在B液的上层；（6）将含有A、B、C三层物质的离心管放入具有水平转子的冷冻离心机离心；（7）将离心后的离心管取出置于冰上，可以看到A、B、C三层物质均有明显的分层，用吸管缓慢吸出A、B、C中的物质，随后用相差显微镜镜检观察，其中A层为细菌营养体，B层为萌发的芽孢，C层为未萌发芽孢。
[0008]进一步，所用枯草芽孢杆菌菌种为Bacillus subtilis 168，购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），菌株编号1.1088。
[0009]进一步，步骤a中B. subtilis 168菌株的活化方法如下：将新鲜枯草芽孢杆菌菌株B. subtilis 168接种到20 mL LB肉汤培养基中，于37℃、200 rpm培养24 h对菌种进行活化，标记为一代。
[0010]进一步，将细菌悬液转接到促芽孢生长培养基DSM中在180
‑
200rpm、36
‑
38℃的条件下培养20
‑
24h。
[0011]进一步，骤b中细菌悬液与促芽孢生长培养基DSM的体积比为1:100。
[0012]进一步，步骤b中促芽孢生长培养基DSM培养基制备方法：A液：970 mL去离子水中加入营养肉汤培养基（购自BD Difco）8
‑
12g，质量分数为1.2%MgSO4溶液8
‑
10 mL、质量分数为10%的KCl溶液8
‑
12 mL、浓度为1 M的 NaOH溶液0.5mL定容至1L，高压灭菌；B液：浓度为1 M的Ca(NO3)
2 溶液、浓度为1 M的MnCl2溶液、浓度为1 M的FeSO4溶液，通过0.22 μm无菌滤膜除菌；使用时待A液冷却至室温后，分别取1
‑
1.2mL B液中三种组分加入到A液即可。
[0013]进一步，步骤c中的离心收集是在6000
‑
8000rpm、3
‑
4℃的条件下离心8
‑
10 min。
[0014]进一步，步骤（6）中冷冻本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速制备和纯化枯草芽孢杆菌芽孢的方法；其特征在于，包括如下步骤：（一）芽孢的制备：a、将活化三代后的B. subtilis 168菌株在LB平板上划线过夜培养至长出单菌落，挑选新鲜的单菌落转接到20 mL LB液体培养基中200 rpm、37℃过夜培养至OD
600 为1.2
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1.5；b、将步骤（2）中细菌悬液转接到促芽孢生长培养基DSM中培养20
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24h得到芽孢悬液；c、离心收集步骤b中芽孢悬液，得到未纯化芽孢悬液，用相差显微镜镜检芽孢形态，产芽孢率≥85%；（二）芽孢纯化：（1）配备质量分数为65
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75%、80
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85%、90
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95%的蔗糖溶液，分别记为A、B、C溶液；（2）取20
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30mL步骤c中未纯化芽孢悬液离心，用4
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6 mL A溶液将芽孢重悬，使得芽孢悬液OD
600
≥ 20，置于冰上10
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30 min；（3）用一次性吸管吸取15
‑
25 mL C溶液加入到50 mL无菌离心管中，防止溶液碰到管壁；（4）用一次性吸管吸取4
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6 mL B溶液，逐滴、缓慢加入到C溶液上表面；（5）将含有芽孢悬液的A溶液逐滴、缓慢加入到B溶液上表面，加入完后芽孢悬液在B液的上层；（6）将含有A、B、C三层溶液的离心管放入具有水平转子的冷冻离心机离心；（7）将离心后的离心管取出置于冰上，可以看到离心管内分为明显的上、中、下三层，用吸管缓慢吸出上、中、下三层中的物质，随后用相差显微镜镜检观察，其中上层为细菌营养体，中层为萌发的芽孢，下层为未萌发芽孢。2.根据权利要求1所述的快速制备和纯化枯草芽孢杆菌芽孢的方法，其特征在于：所用枯草芽孢杆菌菌种为Bacillus subtilis 168，购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），菌株编号1.1088。3.根据权利要求1所述的快速制备和纯化枯草芽孢杆菌芽孢的方法，其特征在于：步骤a中B. subtilis 168菌株的活化方法如下：将新鲜枯草芽孢杆菌菌株B. subtilis 168接种到...

【专利技术属性】
技术研发人员：李苗云，梁栋，王娜，朱瑶迪，赵丽君，徐丽娜，马阳阳，赵改名，孙灵霞，柳艳霞，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：