一种双联混合发酵制备抗菌肽饲料添加剂的方法技术

本发明专利技术属于生物工程制造领域，公开了一种双联混合发酵制备抗菌肽饲料添加剂的方法，包括地衣芽孢杆菌双联乳酸片球菌种子液制备、地衣芽孢杆菌双联乳酸片球菌发酵液制备、高压匀浆破壁、分离和超滤纯化、喷雾干燥等步骤。本发明专利技术通过选定特定地衣芽孢杆菌(CGMCC No.24209)与乳酸片球菌双联混合发酵，使得双联混合发酵后得到的抗菌肽粗品抗菌效价高，并对小麦赤霉菌有很好的抑菌效果；利用地衣芽孢杆菌和乳酸片球菌发酵过程中好氧菌与厌氧菌的生理特性互补的特点，使得在发酵后得到的抗菌肽粗品活性更强。菌肽粗品活性更强。菌肽粗品活性更强。

A method for preparing antibacterial peptide feed additive by duplex mixed fermentation

【技术实现步骤摘要】
一种双联混合发酵制备抗菌肽饲料添加剂的方法


[0001]本专利技术涉及生物工程制造领域，具体涉及一种双联混合发酵制备抗菌肽饲料添加剂的方法。

技术介绍

[0002]传统抗生素以及杀菌剂的使用导致越来越多病原微生物和环境害虫产生耐药性，如β
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内酰胺类抗生素的过敏反应以及长期使用导致耐药菌株的产生。
[0003]在养殖业中，由于长期在养殖过程中使用抗生素，导致病源微生物产生了耐药性，产生环境污染，威胁食品安全等突出问题。因此，抗生素替代品就成为市场需求的热点。抗菌肽具有无残留，无耐药性，促进动物肠道健康等优点，逐渐成为“饲料禁抗”后的一个研究热点。
[0004]抗菌肽作为一种新型的小分子碱性多肽，在动物、植物及细菌中广泛存在。因其具有高效性、抗菌谱广、溶解性好、耐热性强、pH适应范围广及对高等动物安全无毒等优点而受到广泛关注。
[0005]现有技术绝大多数是转基因菌种发酵制备抗菌肽，如专利号为 CN103194411B的《一种枯草芽孢杆菌及其在生产抗菌肽中的应用》，，或者是物理或化学方法提取抗菌肽，如专利号为CN101530434 B的《含蚕抗菌肽的蚕粉或蛹粉以及蛹血清粉的制备方法及其应用》。但双联菌种混合液体发酵鲜有报道，因此，亟需一种双联混合发酵制备抗菌肽饲料添加剂的方法来满足市场需求。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的就在于增加抗菌肽粗品抑菌范围扩展到小麦赤霉菌，并降低分离纯化成本，增加其在饲料添加剂中的应用，提供一种双联混合发酵制备抗菌肽饲料添加剂的方法。
[0007]为达到上述目的，本专利技术是按照以下技术方案实施的：
[0008]一种双联混合发酵制备抗菌肽饲料添加剂的方法，包括以下步骤，
[0009]S1地衣芽孢杆菌双联乳酸片球菌种子液制备，将地衣芽孢杆菌和乳酸片球菌活化接种到种子液液体培养基中发酵，获得地衣芽孢杆菌双联乳酸片球菌种子液；
[0010]S2地衣芽孢杆菌双联乳酸片球菌发酵液制备，将步骤S1获得的地衣芽孢杆菌双联乳酸片球菌种子液接种到液体发酵培养基中发酵，接种后发酵40～60h，得到地衣芽孢杆菌双联乳酸片球菌发酵液；
[0011]S3高压匀浆破壁，将地衣芽孢杆菌双联乳酸片球菌发酵液打入高压匀浆机中进行细胞破碎，得到菌体破壁混合液；
[0012]S4分离和超滤纯化，将步骤S3获得的菌体破壁混合液在离心机中离心，得到上清液和沉淀，将上清液送入超滤膜进行分离纯化，得到抗菌肽粗品浓缩液；
[0013]S5喷雾干燥，将步骤S4获得的抗菌肽粗品浓缩液进行喷雾干燥，获得双联混合发
酵抗菌肽饲料添加剂。
[0014]优选的，所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2021年12月29日，保藏号为 CGMCC No.24209；所述乳酸片球菌来源为CICC，菌株编号为CICC 24367。
[0015]优选的，步骤S1中，所述地衣芽孢杆菌双联乳酸片球菌种子液内的地衣芽孢杆菌菌体浓度为1
×
107～1
×
10
11
CFU/ml，地衣芽孢杆菌双联乳酸片球菌种子液内的乳酸片球菌菌体浓度为1
×
105～1
×
108CFU/ml。
[0016]优选的，所述步骤S1中，每升种子液液体培养基中包含：葡萄糖15～20g、蛋白胨5～15g、蔗糖6～20g、酵母提取物10～30g、氯化钠0.2～0.6g、硫酸镁0.3～0.8g、硫酸锰0.05～0.08g、柠檬酸三铵2～5g、磷酸氢二钾3～6g，其余为纯水。
[0017]优选的，所述步骤S1的发酵条件为：pH值为5.5～7.5，发酵温度为25～ 40℃，发酵时间为24～48h。
[0018]优选的，所述步骤S2中，地衣芽孢杆菌双联乳酸片球菌种子液以2～8％的接种量接种至液体发酵培养基；每升所述液体发酵培养基包含：豆饼粉20～40g、玉米浆10～30g、牛骨蛋白粉10～25g、氯化钠1～5g、磷酸氢二钾2～8g、磷酸二氢钾2～8g、硫酸镁0.5～3g、其余为水；
[0019]步骤S2的发酵条件为：pH值为5.5～7.5，发酵温度为25～40℃，发酵时间为36～60h。
[0020]优选的，所述步骤S3中，高压匀浆机的工艺参数为：流量为5～15L/h，压力为15～30Mpa。
[0021]优选的，所述步骤S4中，所述离心机为碟式离心机；碟式离心机的转速为 4000～6000rpm，离心时间10～30min；超滤膜进行分离纯化过程中，超滤膜的截留的抗菌肽粗品的分子量范围为5～30KD。
[0022]优选的，所述步骤S5中，抗菌肽粗品浓缩液内加入有抗菌肽粗品浓缩液质量的5～15％的保护剂，再进行喷雾干燥；所述保护剂为可溶性糊精、可溶性淀粉、可溶性乳清粉中的至少一种。
[0023]优选的，所述步骤S5中，将加入保护剂的抗菌肽粗品浓缩液的喷雾干燥条件为：进口温度100～150℃，进料速度500～1500ml/h，进风量5～20m3/min，喷雾压力0.1～1.3Mpa。
[0024]优选的，所述步骤S5中，喷雾干燥得到的双联混合发酵抗菌肽饲料添加剂中的抗菌肽粗品的分子量在5～28KD之间；所述抗菌肽粗品抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌、小麦赤霉菌生长。
[0025]本专利技术获得的双联混合发酵抗菌肽饲料添加剂中的抗菌肽粗品，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌、小麦赤霉菌的抑菌效价在 1.0
×
103～1
×
105AU/mg内，检测方法参照GB/T 39101
‑
2020
‑
多肽抗菌性测定。
[0026]本专利技术的作用原理：
[0027]本专利技术采用地衣芽孢杆菌和乳酸片球菌混合来进行液体发酵，利用两个菌种的都能产生特定分子量抗菌肽的特性；利用好氧菌和厌氧菌代谢的特性(地衣芽孢杆菌是好氧菌，在生长过程中会消耗大量氧气，乳酸片球菌是厌氧菌，可以在缺氧的环境下生长，在静置培养过程中，培养基中的氧气呈现先被地衣芽孢杆菌利用，氧气被大量消耗后，地衣芽孢
杆菌进入休眠的孢子状态。此时培养基中的氧气浓度降低，有利于乳酸片球菌大量生长繁殖和发酵，两种菌可以协同发酵；在本专利技术中，培养基指的是种子液液体培养基以及液体发酵培养基)，使得好氧菌和厌氧菌双菌联合发酵相互协同，在液体发酵过程中互补，提高其发酵后抗菌肽粗品的得率，降低生产成本，提高抗菌肽粗品产量，使得抗菌肽的分子量在特定范围内有很好的抗菌活性；利用高压匀浆机破碎，离心后膜过滤分离浓缩，得到抗菌肽粗品浓缩液，经过喷雾干燥后获得双联混合发酵的抗菌肽饲料添加剂。本专利技术或的抗菌肽粗品分子量集中在5～30KD范围内，且产生的抗菌肽粗品对小麦赤霉菌有很好的抑菌作用，能够推动抗菌肽在饲料添加剂领域的应本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种双联混合发酵制备抗菌肽饲料添加剂的方法，其特征在于：S1地衣芽孢杆菌双联乳酸片球菌种子液制备，将地衣芽孢杆菌和乳酸片球菌活化接种到种子液液体培养基中发酵，获得地衣芽孢杆菌双联乳酸片球菌种子液；S2地衣芽孢杆菌双联乳酸片球菌发酵液制备，将步骤S1获得的地衣芽孢杆菌双联乳酸片球菌种子液接种到液体发酵培养基中发酵，接种后发酵40～60h，得到地衣芽孢杆菌双联乳酸片球菌发酵液；S3高压匀浆破壁，将地衣芽孢杆菌双联乳酸片球菌发酵液打入高压匀浆机中进行细胞破碎，得到菌体破壁混合液；S4分离和超滤纯化，将步骤S3获得的菌体破壁混合液在离心机中离心，得到上清液和沉淀，将上清液送入超滤膜进行分离纯化，得到抗菌肽粗品浓缩液；S5喷雾干燥，将步骤S4获得的抗菌肽粗品浓缩液进行喷雾干燥，获得双联混合发酵抗菌肽饲料添加剂。2.根据权利要求1所述的一种双联混合发酵制备抗菌肽饲料添加剂的方法，其特征在于：所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2021年12月29日，保藏号为CGMCC No.24209；所述乳酸片球菌来源为CICC，菌株编号为CICC 24367。3.根据权利要求1所述的一种双联混合发酵制备抗菌肽饲料添加剂的方法，其特征在于：步骤S1中，所述地衣芽孢杆菌双联乳酸片球菌种子液内的地衣芽孢杆菌菌体浓度为1
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11
CFU/ml，地衣芽孢杆菌双联乳酸片球菌种子液内的乳酸片球菌菌体浓度为1
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105～1
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108CFU/ml。4.根据权利要求1所述的一种双联混合发酵制备抗菌肽饲料添加剂的方法，其特征在于：所述步骤S1中，每升种子液液体培养基中包含：葡萄糖15～20g、蛋白胨5～15g、蔗糖6～20g、酵母提取物10～30g、氯化钠0.2～0.6g、硫酸镁0.3～0.8g、硫酸锰0.05～0.08g、柠檬酸三铵2～5g、磷酸氢二钾3～6g...

【专利技术属性】
技术研发人员：常艺海，王文龙，牛俊轲，李高强，袁利芹，刘永立，张杰，段丹霞，练豪帅，刘祖琳，
申请(专利权)人：焦作市佰役安生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：