用于优化的干涉散射显微镜的方法和设备技术

本申请公开了通过干涉散射显微镜对样品进行成像的方法和设备，该方法包括用至少一个相干光源对样品进行照射，样品被保持在包括界面的样品位置处，界面具有折射率变化，用照射辐射对样品进行照射以产生来自样品的反向传播信号，反向传播信号包括在界面处反射的光以及被样品散射的光，将反向传播信号分成第一信号和第二信号，使用修改元件修改第二信号，使得第二信号不同于第一信号；将第一信号和第二信号引导到第一检测器和第二检测器上，以分别产生第一图像和第二图像；以及通过处理器比较第一图像和第二图像以确定样品的一个或多个特征。特征。特征。

Method and equipment for optimized interference scattering microscope

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于优化的干涉散射显微镜的方法和设备


[0001]本专利技术涉及用于优化的干涉散射显微镜(在此被称为iSCAT)的方法和设备。

技术介绍

[0002]iSCAT已经成为具有独特的时空分辨率和低至单分子水平的无标记灵敏度的单粒子跟踪的强大方法。
[0003]例如在Kukura等人的“单个病毒的位置和方向的高速纳米级观测跟踪，High
‑
speed nanoscopic tracking of the position and orientation of a single virus”，自然方法(Nature Methods)2009 6：923
‑
935中和Ortega Arroyo等人的“干涉散射显微镜(iSCAT)：超快超灵敏光学显微镜的新领域，(Interferometric scattering microscopy(iSCAT)：new frontiers in ultrafast and ultrasensitive optical microscopy)”，物理化学化学物理(Physical Chemistry Chemical Physics)，201214：15625
‑
15636中公开了iSCAT。
[0004]尽管有很大的潜力，但是由于对定制显微镜、非常规相机和复杂样品照射的要求，限制了iSCAT的广泛应用，从而限制了iSCAT对小到单分子的对象进行稳健和准确的检测、成像和表征的能力。
[0005]在我们之前的专利WO 2018/011591中，我们公开了一种干涉散射显微镜，该干涉散射显微镜包括新型的、增强对比度的空间掩模，该空间掩模被构造成提高参照光场和散射光场的相对幅度。其中描述的显微镜能够实现与常规iSCAT技术相似的灵敏度，但是复杂性和费用大幅降低，使得通过简单的修改和包括空间掩模可以将常规显微镜构造成起到iSCAT的作用。
[0006]然而，对于本申请的专利技术人而言，使用该方法可获得的测量灵敏度的许多限制已经变得明显。
[0007]首先，例如由于激光噪声或其他干扰现象引起的照射中的背景波动通常无法消除，因为这些波动可能带有关于被询问的样品的信息。这种背景特征限制了检测灵敏度。
[0008]第二，可以照射被询问的样品的光的强度受到检测器特征的限制，该检测器特征包括满井容量和读出速度。因此，在更高的照射强度下，必须使用更强的空间掩模来减少到达检测器处的的光的量，从而限制质量范围并且使仪器对外部影响因素更敏感。
[0009]第三，在同一时刻，利用这种显微镜只能获得样品相互作用或事件的单个测量结果，因此无法通过单个分子事件的粒子检测算法导出相关性。
[0010]最后，在设备用于样品质量检测(质量光度测定)的应用中，测量的动态范围受到所选的空间掩模的强度的限制。也就是说，需要对用于高质量检测或低质量检测的设备进行优化。
[0011]本专利技术提供了解决了上述限制中的每一个限制的用于优化的iSCAT技术的方法和设备。在此公开的方法在照射光的一部分已经被样品散射之后通过在设备的检测侧操控图像信号来处理这些限制。

技术实现思路

[0012]根据本专利技术的一个方面，提供了通过干涉散射显微镜对样品进行成像的方法。
[0013]所述方法包括：用至少一个相干光源对样品进行照射，样品被保持在包括界面的样品位置处，界面具有折射率变化，用照射辐射对样品进行照射以产生来自样品的反向传播(backpropagating)信号，反向传播信号包括在界面处反射的光以及被样品散射的光；将反向传播信号分成第一信号和第二信号；使用修改元件修改第二信号，使得第二信号不同于第一信号；将第一信号和第二信号引导到第一检测器和第二检测器上，以分别产生第一图像和第二图像；以及通过处理器比较第一图像和第二图像以确定样品的一个或多个特征。
[0014]空间滤波器被构造成对入射辐射产生强度减小的作用，该强度减小在预定的数值孔径内更大。因此，空间滤波器利用反射的照射光的数值孔径和从在样品位置处的样品中的对象散射的光的数值孔径之间的不匹配，相比于散射光，选择性地降低了照射光的强度。因此，空间滤波器利用了这两个光源的不同的方向性。反射的照射光通常具有相对较小的数值孔径，而样品的表面附近的亚衍射尺寸的对象优先将光散射到高的数值孔径中。因此，在低数值孔径处，空间滤波器引起的强度减小主要影响照射光，并且对散射光的影响最小，从而使成像对比度最大化。
[0015]通过使反向传播信号分开提供了许多优点，这使得能够捕获在同一时刻的样品的两个图像，从而使得能够在没有时间相依性的强度波动(例如由于按顺序的图像获取而导致的照射光源的不一致)的情况下对样品进行研究。
[0016]样品的特性(例如在质量光度测定实验中样品的质量)也可以通过在两个分开的信号中的一个信号到达检测器之前独立地修改该信号来进行研究。这样做也可以消除背景噪声特征，提高测量灵敏度。
[0017]在一些实施例中，至少一个相干光源包括第一激光器和第二激光器，第一激光器和第二激光器的射束在对样品进行照射之前被组合。提供多个光源导致样品上的光子通量更高，从而使将反射信号分束成两个信号更加可行，这两个信号中的每一个信号包括足够的信息以独立地形成样品的图像。
[0018]在一些实施例中，将信号分开包括将反向传播信号分成具有正交偏振的两个信号。将图像通道分成两个正交偏振使得能够研究样品的双折射特性。
[0019]在一些实施例中，将信号分开包括将反向传播信号分成具有不同的光学功率的两个信号。将图像通道分成具有不同光学功率的两个信号使得能够实现参照射束和来自样品的散射光之间的不同平衡。
[0020]在一些实施例中，使第一信号和第二信号中的至少一个信号穿过空间滤波器包括使第一信号穿过第一空间滤波器，并且修改第二信号使得第二信号不同于第一信号包括使第二信号穿过第二空间滤波器，其中，第一空间滤波器和第二空间滤波器各自被构造成对入射辐射产生强度减小的作用，该强度减小在预定的数值孔径内更大，其中，第一信号具有比第二信号更大的光学功率，并且其中，与第一空间滤波器相比，第二空间滤波器对入射辐射实施更大的强度减小。第一空间滤波器和第二空间滤波器可以各自被构造成对入射辐射产生强度减小的作用，该强度减小在预定的数值孔径内更大。第一信号可以具有比第二信号更大的光学功率，并且与第一空间滤波器相比，第二空间滤波器可以对入射辐射实施更
大的强度减小。
[0021]使用之前的设置，使用单个的“通吃型(catch
‑
all)”空间滤波器限制了测量的动态范围，迫使设备针对高的质量或低的质量进行优化。高强度掩模优化了具有低的分子量的粒子的图像捕获，而对于具有高的分子量的粒子，弱的掩模或者甚至没有掩模可能就足够了。将反射信号分成不同强度(例如90：10)的两个信号，并且对每个信号施加适当强度(例如，0.1％和1％)的空间滤波器使得能够通过使一个分开臂优化以用于低的质量并本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.通过干涉散射显微镜对样品进行成像的方法，所述方法包括：用至少一个相干光源对样品进行照射，所述样品被保持在包括界面的样品位置处，所述界面具有折射率变化，用照射辐射对所述样品进行照射以产生来自所述样品的反向传播信号，所述反向传播信号包括在所述界面处反射的光以及被所述样品散射的光；将所述反向传播信号分成第一信号和第二信号；使用修改元件修改所述第二信号，使得所述第二信号不同于所述第一信号；将所述第一信号和所述第二信号引导到第一检测器和第二检测器上，以分别产生第一图像和第二图像；以及通过处理器比较所述第一图像和所述第二图像以确定所述样品的一个或多个特征。2.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括使所述第一信号和所述第二信号中的至少一个信号穿过空间滤波器，所述空间滤波器被构造成对入射辐射产生强度减小的作用，所述强度减小在预定的数值孔径内更大。3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中，所述至少一个相干光源包括第一激光器和第二激光器，所述第一激光器和所述第二激光器的射束在对所述样品进行照射之前被组合。4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，将所述信号分开包括将所述反向传播信号分成具有正交偏振的两个信号。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，将所述信号分开包括将所述反向传播信号分成具有不同的光学功率的两个信号。6.根据权利要求5所述的方法，其中，使所述第一信号和所述第二信号中的至少一个信号穿过空间滤波器包括使所述第一信号穿过第一空间滤波器，并且修改所述第二信号使得所述第二信号不同于所述第一信号包括使所述第二信号穿过第二空间滤波器，其中，所述第一空间滤波器和所述第二空间滤波器各自被构造成对入射辐射产生强度减小的作用，所述强度减小在预定的数值孔径内更大，其中，所述第一信号具有比所述第二信号更大的光学功率，并且其中，与所述第一空间滤波器相比，所述第二空间滤波器对入射辐射实施更大的强度减小。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，修改所述第二信号包括相对于所述第一信号调整所述第二信号的相位。8.根据权利要求7所述的方法，其中，相对于所述第一信号调整所述第二信号的相位包括使所述第二信号穿过相移掩模。9.根据权利要求7或权利要求8所述的方法，其中，调整所述第二信号包括使所述第二信号沿着所述第一信...

【专利技术属性】
技术研发人员：马蒂亚斯，
申请(专利权)人：牛津大学科技创新有限公司，
类型：发明
国别省市：