一种肿瘤干细胞筛选和基于肿瘤干细胞的肿瘤类器官构建方法技术

本发明专利技术提供了一种肿瘤干细胞筛选和基于肿瘤干细胞的肿瘤类器官构建方法。本发明专利技术所述肿瘤类器官构建方法如下：取肿瘤样本置于缓冲液中清洗，加入组织裂解液进行酶解匀浆得到匀浆组织液；将酶解所得匀浆组织液过滤得到组织来源的肿瘤单细胞，对所得肿瘤单细胞进行重悬，并将所得细胞重悬液铺于细胞芯片上，待细胞沉降进入所述细胞芯片的微孔中，加入培养基，培养2

A method of tumor stem cell screening and tumor organoid construction based on tumor stem cells

【技术实现步骤摘要】
一种肿瘤干细胞筛选和基于肿瘤干细胞的肿瘤类器官构建方法


[0001]本专利技术属于生物
，尤其是指一种肿瘤干细胞筛选和基于肿瘤干细胞的肿瘤类器官构建方法。

技术介绍

[0002]类器官(organoid)是一种3D的细胞培养物，在结构及功能上高度模拟人体器官，能够形成类似器官结构并分化出对应功能的细胞功能集合，其具备细胞增殖分化、自我更新、自组装、可长期培养、遗传稳定等特点，在发育生物学、疾病病理学、细胞生物学、再生医学、精准医疗、药物毒性和药效试验，以及药物筛选等方向应用潜力巨大。目前，癌症相关疾病是全球主要的健康问题之一，每年导致约800万人死亡，预计未来这一数字将迅速增加。随着精准医学理念的提出及发展，癌症患者主要的诊断和治疗方法正逐渐从传统标准转向个性化技术。临床肿瘤患者来源的肿瘤类器官构建为肿瘤药物的个性化选择提供可能。
[0003]目前，针对临床肿瘤患者的用药筛选普遍使用2D细胞或PDX(人源性动物移植模型)开展。针对2D细胞，其体外扩增具有一定局限性，在传代后容易丧失原肿瘤的遗传异质性，容易发生优势克隆选择，且与临床个性相关性较低；而PDX模型虽然解决了个性化的关键问题，但移植成功率低、构建成本高、周期长等缺陷限制了其在临床上的大规模使用。因此，临床上可推广的药筛模型需满足周期短、药物通量高、预测效果准确的要求。相对于现有方法，类器官显现出强劲优势。
[0004]然而为了保证药物筛选的准确性，类器官在构建过程中标准需高度统一，对形成类器官的尺寸、细胞来源、细胞种类等进行规范。现今，传统培养条件下的肿瘤类器官需要在Matrigel中嵌入生长，物理参数和生长因子可及性的局部差异可能带来类器官在形状、大小和分布等方面的差异，且该培养方式对形成类器官的细胞类型、数量无法做到均一、标准，且现有芯片的制备方式不能满足肿瘤类器官挑取需要，无法保证药物筛选的准确开展。
[0005]基于此，急需建立一种基于细胞芯片的肿瘤类器官培养方法，在芯片的材质，处理方式、肿瘤类器官的细胞来源、配比、尺寸、用药方式等指标上进行标准化，且自动化的挑取设备对后续类器官的药敏实验等加以规范，为临床肿瘤病人的个性化用药提供指南。

技术实现思路

[0006]为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种肿瘤干细胞筛选和基于肿瘤干细胞的肿瘤类器官构建方法。本专利技术的肿瘤类器官构建思路：(1)病人来源的肿瘤干细胞获取，基于细胞芯片，肿瘤组织来源的肿瘤干细胞由于自我更新较强，可在3天左右自我增殖形成肿瘤球，经过干性功能表征与干性分子标志物的鉴定，可确定此类肿瘤球为肿瘤干细胞球，以此类细胞为核心培养形成的肿瘤类器官可满足细胞来源均一性；(2)尺寸与细胞类型均一的类器官培养，在3cm
×
3cm的细胞芯片上，可形成约62500个大小均一的80μm的肿瘤类器官，经自动化挑取设备挑取后，进行药敏试验的开展，足量大小与质量均一的类器官为药物筛
选的准确性提供可能。
[0007]本专利技术的第一个目的在于提供一种基于肿瘤干细胞的肿瘤类器官的构建方法，包括以下步骤：
[0008](1)取肿瘤样本置于缓冲液中清洗，加入组织裂解液进行酶解匀浆得到匀浆组织液；
[0009](2)将步骤(1)中酶解所得匀浆组织液过滤得到组织来源的肿瘤单细胞，对所得肿瘤单细胞进行重悬，并将所得肿瘤单细胞重悬液铺于细胞芯片上，待细胞沉降进入所述细胞芯片的微孔中，加入培养基，培养1
‑
7天，得到细胞球；
[0010](3)将步骤(2)所得细胞球进行扩增，并铺在改性细胞芯片中，培养2
‑
3天，得到所述肿瘤类器官。
[0011]在本专利技术的一个实施例中，步骤(1)中，所述缓冲液选自PBS缓冲液。
[0012]在本专利技术的一个实施例中，步骤(1)中，所述组织裂解液包括1500U/mL的胶原酶(Collagenase)，1000U/mL的透明质酸酶(hyaluronidase)与DNAse等。
[0013]在本专利技术的一个实施例中，步骤(2)中，所述细胞芯片的微孔直径30μm
‑
1mm；微孔间距5μm
‑
500μm；所述芯片的微孔形状为圆柱、圆锥、长方体或正方体。
[0014]在本专利技术的一个实施例中，步骤(2)中，所述培养基选自添加生长因子的DMEM/F12基础培养基；所述生长因子选自胰岛素(insulin)、氢化可的松(hydrocortisone)、Jagged
‑
1、SB431542、bFGF和EGF中的一种或多种。
[0015]在本专利技术的一个实施例中，所述胰岛素(insulin)含量为2.5
‑
10μg/mL，氢化可的松(hydrocortisone)浓度为0.2
‑
0.8μg/mL，Jagged
‑
1的浓度为0.5
‑
2μM，SB431542的浓度为0.5
‑
3μM，EGF的浓度为10
‑
35ng/mL，bFGF的浓度为5
‑
20ng/mL。
[0016]在本专利技术的一个实施例中，步骤(3)中，所述改性细胞芯片的功能性改性选自氨基改性、羧基改性、等离子处理、多巴胺改性或胶原改性。
[0017]在本专利技术的一个实施例中，所述氨基改性的条件为：采用乳液聚合法制备有机硅的高聚物乳液，并通过添加氨基硅烷偶联剂制得氨基硅氧烷乳液，在催化剂及交联剂的作用下进一步交联成含氨基集团的硅橡胶，在PEI基膜上通过高温固化即可形成氨基改性的PDMS/PEI膜。
[0018]在本专利技术的一个实施例中，所述多巴胺改性的条件为：使用pH 8.5的10mM的tris buffer配置成2mg/mL的多巴胺PDA溶液，将芯片浸泡在PDA溶液中，避光室温过夜孵育，第二天清洗，得到用于培养的芯片。
[0019]在本专利技术的一个实施例中，所述胶原改性的条件为：HFF细胞中转入CBD(胶原结合域)—生长因子融合蛋白表达
‑
质粒，制备富含特定生长因子的ECM，用于类器官的培养。
[0020]在本专利技术的一个实施例中，步骤(3)中，细胞球扩增后铺在改性细胞芯片的具体操作：将细胞球平铺在改性细胞芯片后再加入一层基质；所述基质为水凝胶材质，所述水凝胶的原料选自PEGDA、海藻酸钠、壳聚糖、琼脂糖、明胶或甲基丙烯酸明胶中的一种或多种。
[0021]在本专利技术的一个实施例中，所述基质还可以包括胶原、细胞外基质或特定生长因子。
[0022]在本专利技术的一个实施例中，所述特定生长因子选自EGF、bFGF、Jagged
‑
1。
[0023]在本专利技术的一个实施例中，所述基质的厚度为3
‑
5μm。
[0024]在本专利技术的一个实施例中，胶原或细胞外基质占基质中的质量比为20
‑
60％。
[0025]在本专利技术的一个实施例中，步本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于肿瘤干细胞的肿瘤类器官的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取肿瘤样本置于缓冲液中清洗，加入组织裂解液进行酶解匀浆得到匀浆组织液；(2)将步骤(1)中酶解所得匀浆组织液过滤得到组织来源的肿瘤单细胞，对所得肿瘤单细胞进行重悬，之后铺于细胞芯片上，待细胞沉降进入所述细胞芯片的微孔中，加入培养基培养，得到细胞球；(3)将步骤(2)所得细胞球进行扩增，并铺在改性细胞芯片中，培养2
‑
3天，得到所述肿瘤类器官。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，所述细胞芯片的微孔直径30μm
‑
1mm；微孔间距5μm
‑
500μm；所述细胞芯片的微孔形状为圆柱、圆锥、长方体或正方体。3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，所述培养基选自添加生长因子的DMEM/F12基础培养基；所述生长因子选自胰岛素、氢化可的松、Jagged
‑
1、SB431542、bFGF和EGF中的一种或多种。4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述胰岛素含量为2.5
‑
10μg/mL，氢化可的松浓度为0.2
‑
0.8μg/mL，Jagged
‑
1的浓...

【专利技术属性】
技术研发人员：索广力，赵喆，刘星志，
申请(专利权)人：中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所，
类型：发明
国别省市：