一种温度响应功能复合物、一种外泌体均相分离纯化方法技术

本发明专利技术属于生物样品分离纯化技术领域，具体涉及一种温度响应功能复合物、一种外泌体均相分离纯化方法。本发明专利技术提供的温度响应功能复合物，由温度响应单体和外泌体特异性识别单体相互作用得到；所述相互作用包括化学键键合、主客体作用和生物素

【技术实现步骤摘要】
一种温度响应功能复合物、一种外泌体均相分离纯化方法


[0001]本专利技术属于生物样品分离纯化
，具体涉及一种温度响应功能复合物、一种外泌体均相分离纯化方法。

技术介绍

[0002]外泌体是一类细胞分泌的磷脂双分子层囊泡，直径约30～200nm。外泌体可调节多种细胞功能，包括信号传导、耐药性、免疫反应、癌症进展和转移等。最近，外泌体由于含有疾病特异性蛋白质、核酸、多糖和脂类等生物标志物而备受关注。基于外泌体的液体活检已成为一种无创、灵敏、实时、高特异性和具有成本效益的新型疾病诊断方法。除疾病诊断外，外泌体还可作为治疗工具，用于组织再生、药物输送和癌症治疗。然而，由于现在仍缺乏经济有效的大规模外泌体分离技术，使基于外泌体的临床诊断和治疗仍面临巨大挑战。
[0003]目前，常见的外泌体分离纯化技术主要有超速离心法、微流控法、超滤法、免疫亲和法等。超速离心法是最常用的外泌体纯化手段，采用高速离心力将不同尺寸的细胞外囊泡从溶液中沉淀并纯化出来。该方法需要昂贵的仪器且产率低，难以实现规模化外泌体分离纯化。此外，重复高速离心操作还可能破坏外泌体结构的完整性，从而影响外泌体纯度。微流控法基于微纳米制造工艺，结合声波、介电电泳、微流体黏弹性以及其他物理特性进行外泌体的分离。该方法具有所需样本小、检测速度快及检测成本低等优点，但该方法受限于芯片尺寸，难以实现大规模外泌体的分离纯化和制备。超滤离心法采用超滤技术，配合离心，实现外泌体的分离。该方法简单、省时、成本低，且不影响外泌体的生物活性，但小于膜孔的非外泌体成分或其他混杂蛋白也可以通过滤膜，从而导致外泌体纯度不足。此外，外泌体易吸附于膜上，导致产率降低，同时吸附于膜上的外泌体可阻塞过膜孔，使膜的寿命减短，影响分离效率。
[0004]免疫亲和法主要是利用特异性抗体标记的磁珠与外泌体表面的蛋白进行特异性结合，实现外泌体的分离。该方法特异性高、易于与下游分析手段相结合。但是该方法需将特异性抗体或与特异性识别外泌体表面蛋白的分子固载于固相上，以实现外泌体与溶液中其他成分的分离。常用的固相有磁珠、金属有机框架材料等。固相材料在外泌体的分离捕获中存在以下不足：(1)外泌体溶液和固相分离体系存在微观不均一性，直接导致其在分离低丰度外泌体时，即使采用相同的富集流程，富集结果也难以重现；(2)存在相界面，外泌体需先从水相转移至固相材料，方可实现分离纯化，亲水性的外泌体易在相转移过程中易发生损失，造成回收率低问题，且易发生非特异性蛋白共吸附。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术提供了一种温度响应功能复合物、一种外泌体均相分离纯化方法，本专利技术提供的外泌体均相分离纯化方法利用温度响应功能复合物温度响应特性，实现外泌体的均相分离纯化，回收率高。
[0006]本专利技术提供了一种温度响应功能复合物，由温度响应单体和外泌体特异性识别单
体相互作用得到所述相互作用包括化学键键合、主客体作用和生物素
‑
亲和素相互作用中的一种或多种。
[0007]优选的，所述相互作用为主客体作用时，所述主客体作用的主体由温度响应单体和主体单体反应得到；所述主客体作用的客体由外泌体特异性识别单体和客体单体反应得到；所述主体单体包括冠醚、葫芦脲、杯芳烃和柱芳烃中的一种或多种；所述客体单体包括偶氮苯和/或金刚烷胺。
[0008]优选的，所述化学键包括碳碳键、碳氮键和二硫键中的一种或多种。
[0009]优选的，所述温度响应单体具有温度响应官能团，所述温度响应官能团包括烷基取代酰胺基。
[0010]优选的，所述外泌体特异性识别单体包括外泌体特异性识别抗体、外泌体特异性识别适配体、外泌体特异性识别金属离子、精氨酸、赖氨酸、多羟基类化合物和外泌体特异性识别膜联蛋白中的一种或多种。
[0011]优选的，所述温度响应单体包含聚(N
‑
异丙基丙烯酰胺)和/或聚(N,N
‑
二乙基丙烯酰胺)单元的单体。
[0012]优选的，所述温度响应功能复合物的响应温度为0～40℃。
[0013]本专利技术提供了一种外泌体的均相分离纯化方法，包括以下步骤：
[0014]在第一温度条件下，将温度响应功能复合物和含有外泌体的生物样品溶液混合进行均相孵育，得到孵育液；所述孵育液中含有捕获有外泌体的温度响应功能复合物，所述温度响应功能复合物为上述技术方案所述温度响应功能复合物；
[0015]在第二温度条件下，将捕获有外泌体的温度响应功能复合物从所述孵育液中析出，第一固液分离后得到捕获有外泌体的温度响应功能复合物；
[0016]在第三温度条件下，将捕获有外泌体的温度响应功能复合物溶解于清洗液中均相洗涤净化，得到含有净化的捕获有外泌体的温度响应功能复合物的混合液；
[0017]在第四温度条件下，将温度响应功能复合物从混合液中析出，第二固液分离后得到净化的捕获有外泌体的温度响应功能复合物；
[0018]在第五温度条件下，将所述净化的捕获外泌体的温度响应功能复合物溶解于洗脱液中脱附外泌体，得到含有温度响应功能复合物和外泌体的洗脱液；
[0019]在第六温度条件下，将温度响应功能复合物从洗脱液中析出，第三固液分离后得到纯化的外泌体纯化液；
[0020]所述第一温度、第三温度和第五温度独立地为0～10℃；所述第二温度比所述第一温度高≥5℃，所述第四温度比所述第三温度高≥5℃，所述第六温度比所述第五温度高≥5℃。
[0021]优选的，所述第二温度、第四温度和第六温度独立地为20～40℃。
[0022]优选的，所述第一固液分离分离、第二固液分离和第三固液分离为离心分离，所述第一离心分离、第二离心分离和第三离心分离的速度独立地为3000～8000g。
[0023]本专利技术提供了一种温度响应功能复合物，由温度响应单体和外泌体特异性识别单体相互作用得到；所述相互作用包括化学键键合、主客体作用和生物素
‑
亲和素相互作用中的一种或多种。本专利技术提供的温度响应功能复合物由温度响应单体和外泌体特异性识别单体相互作用得到。其中，外泌体特异性识别单体能够将溶液中的外泌体固定或吸附在温度
响应功能复合物上；同时，温度响应单体能够使温度响应功能复合物具有溶解
‑
沉淀温度响应特性，通过调节温度响应功能复合物溶液的温度使其溶解或沉淀析出，从而实现外泌体的均相分离纯化。
[0024]本专利技术提供了一种外泌体的均相分离纯化方法，包括以下步骤：在第一温度条件下，将温度响应功能复合物和含有外泌体的生物样品溶液混合进行均相孵育，得到孵育液；所述孵育液中含有捕获有外泌体的温度响应功能复合物，所述温度响应功能复合物为上述技术方案所述温度响应功能复合物；在第二温度条件下，将捕获有外泌体的温度响应功能复合物从所述孵育液中析出，第一固液分离后得到捕获有外泌体的温度响应功能复合物；在第三温度条件下，将捕获有外泌体的温度响应功能复合物溶解于清洗液中均相洗涤净化，得到含有净化的捕获有外泌体的温度响本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种温度响应功能复合物，其特征在于，由温度响应单体和外泌体特异性识别单体相互作用得到；所述相互作用包括化学键键合、主客体作用和生物素
‑
亲和素相互作用中的一种或多种。2.根据权利要求1所述的温度响应功能复合物，其特征在于，所述相互作用为主客体作用时，所述主客体作用的主体由温度响应单体或外泌体特异性识别单体与主体单体反应得到；所述主客体作用的客体由特异性识别单体或外泌体温度响应单体与客体单体反应得到；所述主体单体包括冠醚、葫芦脲、杯芳烃和柱芳烃中的一种或多种；所述客体单体包括偶氮苯和/或金刚烷胺。3.根据权利要求1所述的温度响应功能复合物，其特征在于，所述化学键包括碳碳键、碳氮键和二硫键中的一种或多种。4.根据权利要求1所述的温度响应功能复合物，其特征在于，所述温度响应单体具有温度响应官能团，所述温度响应官能团包括烷基取代酰胺基。5.根据权利要求1所述的温度响应功能复合物，其特征在于，所述外泌体特异性识别单体包括外泌体特异性识别抗体、外泌体特异性识别适配体、外泌体特异性识别金属离子、精氨酸、赖氨酸、多羟基类化合物和外泌体特异性识别膜联蛋白中的一种或多种。6.根据权利要求1或4所述的温度响应功能复合物，其特征在于，所述温度响应单体包含聚(N
‑
异丙基丙烯酰胺)和/或聚(N,N
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二乙基丙烯酰胺)单元的单体。7.根据权利要求1所述的温度响应功能复合物，其特征在于，所述温度响应功能复合物的响应温度为0～40℃。8.一种外泌体的均相分离纯化方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：张丽媛，潘玉鹏，
申请(专利权)人：大连医科大学，
类型：发明
国别省市：