一种快速定量唾液中氨基酸及其衍生物的方法和试剂盒技术

本发明专利技术提供了一种快速定量唾液中氨基酸及其衍生物的方法和试剂盒，该氨基酸及其衍生物包括天冬酰氨酸、精氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、牛磺酸、甘氨酸、乙醇胺、胍氨酸、肌氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、β

A method and kit for rapid quantification of amino acids and their derivatives in saliva

【技术实现步骤摘要】
一种快速定量唾液中氨基酸及其衍生物的方法和试剂盒


[0001]本专利技术涉及生物样品检测
，具体涉及一种快速定量唾液中氨基酸及其衍生物的方法和试剂盒。

技术介绍

[0002]十多年前美国杜克大学Christopher B.Newgard发现支链氨基酸在包括糖尿病、肥胖等在内的代谢性疾病存在密切关系，血浆支链氨基酸水平可以预示肥胖、糖尿病的发生、治疗干预的结果。同时芳香族氨基酸水平在肥胖、糖尿病患者血液中发生变化也相继有报道。
[0003]根据2021年国际糖尿病联盟IDF《糖尿病地图集第10版》报告，2021年全球有5.37亿成人糖尿病人，预计2030年增长至6.43亿，2045年达到7.84亿。据《中国2型糖尿病防治指南》分析，我国糖尿病人绝对人数占全球第一，同时在人口中的比例也是世界第一，每100人中有11人，并且在这11中有7人不知道自己血糖超标。
[0004]血糖指标是糖尿病诊断的临床指标，包括空腹血糖、餐后2小时血糖，以及口服葡萄糖后血糖的变化都是糖尿病诊断的黄金指标。除了血糖指标外，目前已有文献报道，血中的氨基酸，包括支链氨基酸等可以作为糖尿病的生物标志物，辅助诊断糖尿病。但以上这些方法都涉及到需要进行有创的血样本的获取。
[0005]氨基酸是人体蛋白质的基本组成单元，同时也参与合成激素、神经递质、碳水化合物、脂肪等机体重要代谢物的合成。
[0006]近年来的研究发现体液，包括血液、唾液、尿液中氨基酸异常与各种疾病相关，比如苯丙酸酮症、精神分裂、阿尔兹海默症、糖尿病、乳腺癌等。所以准确检测氨基酸的方法显得尤为重要。唾液是人体的一种重要的体液，唾液相对于血液来说蛋白含量低，所含成分相对简单。并且唾液的获取是无创性的，操作简单、易于获取。
[0007]目前市面上有很多氨基酸检测试剂盒，比如美国的EZ:faast
TM
、PicoTag
TM
、AQC.Tag
TM
和AQC.Tag Ultra
TM
，La ChromiTRAQ AA45/32
TM
，以及美国FDA批准的氨基酸和酰化肉碱MS/MS分析试剂盒。但目前这些试剂盒均针对血液，包括血清和血浆中的氨基酸的定量测定。
[0008]唾液中氨基酸的检测方法一般有氨基酸分析仪，而气相色谱、毛细管电泳、高效液相以及超高效液相通常与质谱联用，常用质谱有飞行时间质谱、三重四极杆质谱等。由于氨基酸属于极性大的水溶性分子，在反相色谱柱上很难有好的保留，更无法获得各种氨基酸之间的良好分离度。故通常采用衍生的方法加强氨基酸在色谱柱上的保留。针对氨基酸的衍生试剂有印三酮、邻苯二醌、丹璜酰氯、异硫氰酸苯酯以及6
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氨基喹啉
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N
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羟基琥珀酰亚胺氨基甲酸酯(AQC)等。据文献研究报道，印三酮、邻苯二醌、丹璜酰氯的衍生方法存在样本用量大、过程耗时、衍生物不稳定或者操作复杂等问题。
[0009]就目前的文献研究报道，尚未见有将唾液氨基酸谱及代谢物与糖尿病的生物标志物联系起来的报道，也没有对唾液氨基酸谱进行快速定量的技术方法的报道。

技术实现思路

[0010]本专利技术针对测定肥胖、糖尿病等代谢性疾病血液生物标志物需要有创的获取生物样本，且目前唾液氨基酸定量检测方法前处理过程复杂、需要样本用量大，检测定量过程需要专业的质谱技术人员操作、检测时间较长的问题进行改进，提供了一种快速定量唾液中氨基酸及其衍生物的方法和试剂盒。
[0011]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0012]本专利技术的第一方面是提供一种快速定量唾液中氨基酸及其衍生物的方法，该氨基酸及其衍生物包括天冬酰氨酸、精氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、牛磺酸、甘氨酸、乙醇胺、胍氨酸、肌氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、β
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丙氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、酪氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、γ
‑
氨基丁酸、氨基己二酸、β
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氨基异丁酸、α
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氨基酸丁酸；
[0013]上述方法将去除蛋白质的唾液样本用AQC衍生试剂进行唾液衍生前处理，最后将处理好的唾液样本采用超高效液相色谱
‑
质谱检测进行定量测定。
[0014]进一步地，采用预冷过的甲醇溶液去除蛋白。
[0015]进一步地，唾液样本的体积为20μL。
[0016]进一步地，AQC衍生试剂为采用乙腈配制而成的，其中6
‑
氨基喹啉
‑
N
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羟基琥珀酰亚胺氨基甲酸酯的浓度为8
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14mmol/L，优选为10mmol/L。
[0017]进一步地，上述唾液衍生前处理的条件为50℃下加热、振摇10分钟。
[0018]进一步地，上述质谱检测选自QDa检测，或单四极杆、三重四极杆、飞行时间、四极杆与飞行时间串联，离子阱质谱检测中的任一质谱仪。
[0019]进一步地，上述超高效液相色谱的条件如下：
[0020]反相色谱柱，粒径为1.6μm，50mm长；
[0021]流动相：A相：浓度为0.01％的甲酸水溶液，B相：含0.01％甲酸的乙腈溶液；
[0022]梯度洗脱条件为：0
–
0.1min 99.9％
–
90％A相，0.1
–
1min 90％
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85％A相，1
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1.5min85％
–
83％A相，1.5
–
3min 83％
–
80％A相，3
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3.5min80％
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1％A相，3.5
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4min1％A相，4
–
4.1min 1％
–
99％A相，4.1
–
6min 99％A相；
[0023]流速：0.5ml/min；
[0024]进样体积：1μL。
[0025]本专利技术的第二方面是提供一种快速定量唾液中氨基酸的试剂盒，该试剂盒包括上述方法实施过程中所采用的试剂和器材。
[0026]本专利技术的第三方面是提供用于快速定量唾液中氨基酸及其衍生物的试剂在制备诊断代谢性疾病的试剂盒中的应用，该试剂盒包括上述方法实施过程中所采用的试剂。
[0027]进一步地，代谢性疾病包括肥胖、糖尿病、心血管疾病，其中糖尿病包括1型、2型糖尿病和妊娠糖尿病；该试剂盒诊断代谢性疾病的指标是各个氨基酸或其衍生物的含量，或者各个氨基酸或其衍生物相对于其它氨基酸及其衍生物总和的比例。
[0028]本专利技术的第四方面是提供用于快速定量唾液中支链氨基酸和/或芳香族氨基酸的试剂在制备诊断肥胖或糖尿病的试剂盒中的应用，该试剂盒包括上述方法实施过程中所采用的试剂，上述支链氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速定量唾液中氨基酸及其衍生物的方法，其特征在于，所述氨基酸及其衍生物包括天冬酰氨酸、精氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、牛磺酸、甘氨酸、乙醇胺、胍氨酸、肌氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、β
‑
丙氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、酪氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、γ
‑
氨基丁酸、氨基己二酸、β
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氨基异丁酸、α
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氨基酸丁酸；所述方法将去除蛋白质的唾液样本用AQC衍生试剂进行唾液衍生前处理，最后将处理好的唾液样本采用超高效液相色谱
‑
质谱检测进行定量测定。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用预冷过的甲醇溶液去除蛋白。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，唾液样本的体积为20μL。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述AQC衍生试剂为采用乙腈配制而成的，其中AQC的浓度为8
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14mmol/L，优选为10mmol/L。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述唾液衍生前处理的条件为50℃下加热、振摇10分钟。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述质谱检测选自QDa质谱检测，或单四极杆、三重四极杆、飞行时间、四极杆与飞行时间串联、离子阱质谱检测中的任一质谱仪。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述超高效液相色谱的条件如下：反相色谱柱，粒径为1.6μm，50mm长；流动相：A相：浓度为0.01％的甲酸水溶液，B相：含0.01％甲酸的乙腈溶液；梯度洗脱条件为：0
–
0.1min 99.9％
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90％A相，0.1
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1min 90％
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85％A相，1
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【专利技术属性】
技术研发人员：贾伟，赵爱华，瞿纯，包玉倩，
申请(专利权)人：上海市第六人民医院，
类型：发明
国别省市：