针对10-乙酰基-3,7-二羟基吩噁嗪的过氧化物酶活性制造技术

本发明专利技术提供了工程化过氧化物酶、具有过氧化物酶活性的多肽和编码这些酶的多核苷酸，以及载体和包含这些多核苷酸和多肽的宿主细胞。还提供了用于产生过氧化物酶的方法。本发明专利技术还提供了包含所述过氧化物酶的组合物和使用所述工程化过氧化物酶的方法。本发明专利技术在药物和其他化合物的产生中特别有用。他化合物的产生中特别有用。

Peroxidase activity against 10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】针对10
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乙酰基
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3,7
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二羟基吩噁嗪的过氧化物酶活性
[0001]本申请要求2019年9月12日提交的美国临时专利申请序列第62/899,190号的优先权，该申请出于所有目的通过引用以其整体并入。
专利

[0002]本专利技术提供了工程化过氧化物酶、具有过氧化物酶活性的多肽和编码这些酶的多核苷酸，以及载体和包含这些多核苷酸和多肽的宿主细胞。还提供了用于产生过氧化物酶的方法。本专利技术还提供了包含所述过氧化物酶的组合物和使用所述工程化过氧化物酶的方法。本专利技术在药物和其他化合物的产生中特别有用。
[0003]对序列表、表格或计算机程序的引用
[0004]序列表的正式副本作为ASCII格式化文本文件经由EFS
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Web与说明书同时被提交，具有文件名“CX2
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190USP1_ST25.txt”，创建日期2019年9月11日，且大小为852千字节。经由EFS
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Web提交的序列表为说明书的一部分并且通过引用以其整体并入本文。
[0005]专利技术背景
[0006]过氧化物酶，尤其是辣根过氧化物酶(HRP)，在免疫组织化学应用和氧化反应中有广泛使用。辣根过氧化物酶(EC 1.11.1.7)是利用过氧化氢氧化有机底物的铁依赖性酶，并且还已知其通过在正常氧化酶催化循环期间使活性位点的非活性氧化还原态氧化来促进氧化酶催化活性。HRP是44kDa的蛋白，其中多肽为33kDa，并且糖基化占剩余质量。在工业应用中使用的HRP的一个缺点是难以在细菌系统中高效表达高度糖基化的蛋白。因此，有对易于表达且能够实现高收率氧化酶反应的HRP的替代品的需要。替代性过氧化物酶在其他氧化化学中也可有利用。
[0007]专利技术概述
[0008]本专利技术提供了能够使用过氧化氢作为电子供体氧化10
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乙酰基
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3,7
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二羟基吩噁嗪(Amplex Red)的工程化DyP型过氧化物酶、多肽和编码这些酶的多核苷酸，以及载体和包含这些多核苷酸和多肽的宿主细胞。还提供了用于产生过氧化物酶的方法。本专利技术还提供了包含所述过氧化物酶的组合物和使用所述工程化过氧化物酶的方法。本专利技术在药物和其他化合物的产生中特别有用。
[0009]DyP型过氧化物酶(DyP)(EC编号1.11.1.19)是染料脱色过氧化物酶家族。该酶是使用过氧化氢为电子供体催化许多底物的氧化的含有血红素(haem)的蛋白。在该过程中使用的工程化DyP过氧化物酶具有源自来自蓝细菌鱼腥藻属(念珠藻属)种(Anabaena(Nostoc)sp.)(菌株PCC 7120)的野生型过氧化物酶Alr1585的序列的序列。
[0010]本专利技术提供了包含与SEQ ID NO:4和/或6具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列的工程化过氧化物酶或其功能片段。在一些实施方案中，工程化过氧化物酶在多肽序列中包含至少一个取代或取代集，并且其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:4和/或6编号。在工程化过氧化物酶的一些另外的实施方案中，多肽序列与SEQ ID NO:4具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的
序列同一性。在一些实施方案中，工程化过氧化物酶在多肽序列中选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：25/29/43、25/29/65/82/92、26/29、80/128/306、90、127/168、127/301、128/307、143、160、160/188、160/307、164、168、171/260、185、185/307、189/190/226、191、191/260、191/469、202、206、208、221、222、224、224/260、226、228、228/260、241/270/283/306、260/307、290、301、306、307、311、332、367和393，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:4编号。在一些实施方案中，工程化过氧化物酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：25A/29A/43Y、25Q/29A/65G/82K/92G、26E/29K、80K/128K/306F、90Q、90Y、127K/168S、127K/301I、128K/307N、128K/307Q、143H、143R、143S、143V、160H/188V、160M、160R、160V/307C、164D、164K、168H、168K、168M、168S、168W、171V/260R、185E/307H、185Q、185T、189W/190V/226P、191A、191D、191G、191S、191S/260R、191S/469V、202W、206L、208N、221D、221H、221L、221M、221P、221R、221S、221T、221Y、222E、222G、222S、222V、224L、224P、224R、224R/260R、224Y、226I、226V、228G、228M/260R、241K/270N/283T/306L、260R/307T、290L、301S、301V、301W、306A、306K、306V、307C、307D、307E、307G、307L、307M、307R、307S、311I、311V、332A、367G和393D，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:4编号。在一些另外的实施方案中，工程化过氧化物酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：R25A/N29A/H43Y、R25Q/N29A/S65G/F82K/D92G、N26E/N29K、E80K/E128K/T306F、S90Q、S90Y、E127K/N168S、E127K/L301I、E128K/Y307N、E128K/Y307Q、L143H、L143R、L143S、L143V、I160H/I188V、I160M、I160R、I160V/Y307C、L164D、L164K、N168H、N168K、N168M、N168S、N168W、T171V/L260R、D185E/Y307H、D185Q、D185T、L189W/R190V/F226P、N191A、N191D、N191G、N191S、N191S/L260R、N191S/A469V、F202W、V206L、Q208N、V221D、V221H、V221L、V221M、V221P、V221R、V221S、V221T、V221Y、N222E、N222G、N222S、N222V、C224L、C224P、C224R、C224R/L260R、C224Y、F226I、F226V、K228G、K228M/L260R、E241K/D270N/N283T/T306L、L260R本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种工程化过氧化物酶，所述工程化过氧化物酶包含与SEQ ID NO:4和/或6具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，其中所述工程化过氧化物酶在所述多肽序列中包含至少一个取代或取代集，并且其中所述多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:4和/或6编号。2.根据权利要求1所述的工程化过氧化物酶，其中所述多肽序列与SEQ ID NO:4具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性，并且其中所述工程化过氧化物酶在所述多肽序列中选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：393、25/29/43、25/29/65/82/92、26/29、80/128/306、90、127/168、127/301、128/307、143、160、160/188、160/307、164、168、171/260、185、185/307、189/190/226、191、191/260、191/469、202、206、208、221、222、224、224/260、226、228、228/260、241/270/283/306、260/307、290、301、306、307、311、332和367，并且其中所述多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:4编号。3.根据权利要求1所述的工程化过氧化物酶，其中所述多肽序列与SEQ ID NO:6具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性，并且其中所述工程化过氧化物酶在所述多肽序列中选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：393、25/29/43、25/29/65/82/92、80/128/306、90、127/301、128/307、143、160、160/188、160/307、164、168、171/260、185、185/307、191、191/260、191/469、202、206、208、221、222、224、224/260、228、228/260、241/270/283/306、260/307、301、306、307、311、332和367，其中所述多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:6编号。4.根据权利要求1所述的工程化过氧化物酶，其中所述工程化过氧化物酶包含与表5.1和/或表6.1中列出的至少一种工程化过氧化物酶变体的序列至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的多肽序列。5.根据权利要求1所述的工程化过氧化物酶，其中所述工程化过氧化物酶包含与SEQ ID NO:4和/或6中列出的至少一种工程化过氧化物酶变体的序列至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的多肽序列。6.根据权利要求1所述的工程化过氧化物酶，其中所述工程化过氧化物酶是SEQ ID NO:4和/或6中列出的变体工程化过氧化物酶。7.根据权利要求1所述的工程化过氧化物酶，其中所述工程化过氧化物酶包含与SEQ ID NO:6
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【专利技术属性】
技术研发人员：段达，奥里克，
申请(专利权)人：科德克希思公司，
类型：发明
国别省市：