SARS-CoV-2中和性纳米抗体、自组装铁蛋白融合纳米抗体及制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了SARS

【技术实现步骤摘要】
ID NO.1所述蛋白的核苷酸序列进行优化改造，对影响基因转录效率、翻译效率和蛋白折叠的GC含量、CpG二核苷酸含量、密码子偏好性、mRNA的二级结构、mRNA自由能稳定性、RNA不稳定性基因序列、重复序列等多种相关参数进行优化设计，并保持最终翻译成的蛋白序列不变，优化后的编码基因的核苷酸序列分别为SEQ ID NO.2所示。
[0007]本专利技术在序列优化之后对SEQ ID NO.2所编码的蛋白分别进行氨基酸单位点突变以及双位点突变以提高其表达量和对SARS
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CoV
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2假病毒的中和活性，即本专利技术以优化后的H11
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D4基因序列（其核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示）为模板，设计多对引物对序列进行定点突变，具体的，本专利技术将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列按照L12A，V25S，A33T，P42L，W54M，S64Y，N78Q，A93G，R104K，D116E或V124S中的任何一种氨基酸单位点突变方式获得了多个单位点突变体；本专利技术将上述这些单位点突变体在大肠杆菌表达系统中分别进行了表达，根据表达结果可见：将SEQ ID NO.1按照A33T、W54M、S64Y或R104K的突变位点进行突变，获得的4个突变体的产量和中和SARS
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CoV
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2假病毒的能力明显提高；基于所确定的部分单位点的突变是有效突变，可以达到提高Ferritin
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H11
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D4突变体表达量的效果，考虑到氨基酸的排列顺序是蛋白质的一级结构决定着蛋白质的高级结构且上述进行的氨基酸单位点突变有部分突变位点的位置可能是相互关联的，本专利技术将可以提高表达量的这4个单突变位点(A33T、W54M、S64Y或R104K )两两组合进行双位点突变，具体如下：将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列分别按照A33T
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W54M、A33T
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S64Y、A33T
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R104K、W54M
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S64Y、W54M
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R104K或S64Y
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R274K进行双位点突变；将上述双突变位点在大肠杆菌中表达，实验结果证明将SEQ ID NO.1所述氨基酸序列分别按照W54M
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R104K或W224M
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R274K进行双位点突变后，在表达量和相应的中和假病毒活性有最为明显的提高。
[0008]本专利技术的第二方面是提供SARS
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CoV
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2中和性纳米抗体的单位点突变体以及双位点突变体，其中，所述的SARS
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CoV
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2中和性纳米抗体的单位点突变体是将SEQ ID NO.1按照A33T、W54M、S64Y或R104K中的任何一种单位点突变所获得的任何一种单位点突变体，所述的SARS
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CoV
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2中和性纳米抗体的双位点突变体是将SEQ ID NO.1所述氨基酸序列按照W54M
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R104K或W224M
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R274K进行双位点突变后所得到任何一种双位点突变体。
[0009]本专利技术的第三方面是提供了一种将SARS
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CoV
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2中和性纳米抗体或SARS
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CoV
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2中和性纳米抗体的突变体与单体铁蛋白亚基融合在一起得到的自组装铁蛋白融合纳米抗体；作为本专利技术一种优选的实施方式，将SARS
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CoV
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2中和性纳米抗体或SARS
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CoV
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2中和性纳米抗体的突变体与单体铁蛋白亚基的C端连接得到的自组装铁蛋白融合纳米抗体，其中，所述单体铁蛋白亚基包括但不限于细菌铁蛋白、植物铁蛋白、藻铁蛋白、昆虫铁蛋白、真菌铁蛋白或哺乳动物铁蛋白中的任何一种；优选的，所述单体铁蛋白亚基是人铁蛋白重链亚基，其氨基酸原始序列为NCBI上GenBank序列号：AAA35832.1所示。所述SARS
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CoV
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2中和性纳米抗体是SARS
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CoV
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2中和性纳米抗体H11
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D4，其氨基酸原始序列为PDB序列号: 6YZ5_F，为了使H11
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D4更好的展示在铁蛋白表面，将GGGSGGGGSGGGS（其氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示）作为linker添加到SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的N端后与去掉了前5个及后21个氨基酸的铁蛋白C端相连接得到自组装铁蛋白融合纳米抗体（将该自组装铁蛋白融合纳米抗体命名为Ferritin
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H11
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D4），其氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示。
[0010]本专利技术利用OptimumGene
TM
技术，根据大肠杆菌与家蚕密码子偏好性，对编码SEQ ID NO.3所述氨基酸序列的核苷酸序列进行优化改造，对影响基因转录效率、翻译效率和蛋
白折叠的GC含量、CpG二核苷酸含量、密码子偏好性、mRNA的二级结构、mRNA自由能稳定性、RNA不稳定性基因序列、重复序列等多种相关参数进行优化设计，并保持最终翻译成的蛋白序列不变。优化后的的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示（Ferritin
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H11
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D4基因序列）。
[0011]本专利技术在序列优化之后对融合蛋白分别进行氨基酸单位点突变和双位点突变，以提高其表达量和对SARS
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CoV
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2假病毒的中和活性，即本专利技术以优化后的Ferritin
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H11
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D4基因序列（其核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示）为模板，设计多对引物对序列进行定点突变，具体的，本专利技术将SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列按照L182A，V195S，A203T，P212L，W224M，S234Y，N248Q，A263G，R274K，D286E或V294S中的任何一种氨基酸单位点突变方式获得了多个单位点突变体。
[0012]本专利技术将上述这些单位点突变体在大肠杆菌表达系统中分别进行了表达，根据表达结果可见：将SEQ ID NO.3按照A203T、W224M、S234Y或R274K的突变位点进行突变获得的4个突变体，其产量和中和SARS
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CoV假病毒的能力也有很大的提高。
[0013]基于所确定的部分单位点的突变是有效突变，可以达到提高Ferritin
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H11
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D4突变体表达量的效果，考虑到氨基酸的排列顺序是蛋白质的一级结构决定着蛋白质的高级结构且上述进行的氨基酸单位点突变有部分突变位点的位置可能是相互关联的，本专利技术将可以有效提高表达量的这4个单突变位点(A33T、W5本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体为SARS
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CoV
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2中和性纳米抗体，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。2.权利要求1所述的纳米抗体的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。3.权利要求1所述的纳米抗体的突变体，其特征在于，所述突变体选自（1）或者（2）中的任何一种：(1)将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列按照A33T、W54M、S64Y或者R104K中的任何一种单位点进行突变所获得的突变体；（2）将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列按照W54M
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R104K或者W224M
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R274K进行双位点突变得到的突变体。4.一种自组装铁蛋白融合纳米抗体，其特征在于，将权利要求1所述的纳米抗体或权利要求3所述的纳米抗体的突变体与单体铁蛋白亚基融合在一起得到的自组装铁蛋白融合纳米抗体。5.根据权利要求4所述的自组装铁蛋白融合纳米抗体，其特征在于，将权利要求1所述的纳米抗体或权利要求3所述的纳米抗体的突变体与单体铁蛋白亚基的C端通过linker融合在一起得到自组装铁蛋白融合纳米抗体；所述单体铁蛋白亚基包括但不限于细菌铁蛋白、植物铁蛋白、藻铁蛋白、昆虫铁蛋白、真菌铁蛋白或哺乳动物铁蛋白中的任何一种；所述linker的氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示。6.根据权利要求5所述的自组装铁蛋白融合纳米抗体，其特征在于，其氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示。7.权利要求4
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6任何一项所述的自组装铁蛋白融合纳米抗体的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示。8.权利要求4所述自...

【专利技术属性】
技术研发人员：李轶女，张志芳，刘兴健，高新桃，易咏竹，王海宁，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：