一种树鼩睾丸间质细胞的分离培养方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种树鼩睾丸间质细胞的分离培养方法及其应用，该方法包括分离、纯化。本发明专利技术成功建立树鼩睾丸间质细胞的分离培养方法，确定了寨卡病毒（Zika virus，Zikv）对树鼩睾丸间质细胞的易感性和病毒增殖特性，为Zikv入侵生殖系统机制研究提供基础。生殖系统机制研究提供基础。生殖系统机制研究提供基础。

【技术实现步骤摘要】
一种树鼩睾丸间质细胞的分离培养方法及其应用


[0001]本专利技术涉及细胞培养及应用领域，尤其是一种树鼩睾丸间质细胞的分离培养方法及其应用。

技术介绍

[0002]寨卡病毒（Zika virus, Zikv）为单股正链RNA病毒,主要通过病毒感染的伊蚊类蚊媒叮咬传播,寨卡病毒能够靶向感染神经前体细胞，抑制神经干细胞增殖并引起其分化异常，并最终导致大脑皮层变薄、脑腔体积变大，出现小头症表现。此外，研究表明将寨卡病毒感染可导致小鼠睾丸发生炎症。严重时会引起睾丸内部结构受损及细胞大量死亡，对男性生殖健康带来潜在威胁，但其相关感染机制尚不明确。
[0003]睾丸间质细胞（Leydig cells，LCs）主要分布于生精小管之间，是睾丸主要细胞类型之一。LCs在毒理学、药理学及生殖遗传学等研究方面具有十分重要的应用意义，其功能主要是分泌睾酮，是睾丸中唯一能够分泌睾酮的细胞，可促进精子的发生和男性生殖器官发育，以及维持第二性征和性功能，大约95%的雄激素由其分泌，在生殖上具有不可替代的作用，研究发现LCs数量缺少会导致雄性激素缺乏，从而引起生殖上的问题，体外分离培养纯度高、活性强的LCs可更好的研究其相关机制和特性。
[0004]目前对LCs分离培养主要集中在大小鼠、牛羊等哺乳动物上，但对于新型实验动物树鼩的LCs分离培养鲜有报道。树鼩（Tree shrew，tupaia belangeri）在生理、生化、新陈代谢、解剖结构以及基因组等生物学特性比啮齿类更接近于非人灵长类，且由于体型小、繁殖快等特点，且对许多人类病毒易感而导致疾病，已广泛应用于人类疾病模型的研究，包括病毒感染模型、肿瘤模型、呼吸系统疾病模型和神经系统疾病模型等。
[0005]睾丸中主要有生精细胞、支持细胞和间质细胞等，其中LCs占睾丸细胞的2%~4%，数量较少且纯化难度较大，因此找到一种合适的分离纯化方法至关重要。目前对于睾丸间质细胞的分离培养主要有机械分离法、组织块贴壁法、酶消化法、percoll密度梯度离心法等几种方法，机械分离法对细胞损伤较大，组织块贴壁法杂细胞太多且周期较长，percoll密度梯度离心法得到的细胞仍存在其他杂细胞，还需要添加各种营养成分和生长因子。
[0006]如何提高分离效率，通过Zikv对LCs的感染特性研究，建立Zikv感染的睾丸细胞模型，为研究Zikv感染雄性生殖系统的相关研究提供实验基础，是值得研究的。

技术实现思路

[0007]为了解决上述问题，本专利技术提出一种树鼩睾丸间质细胞的分离培养方法及其应用。
[0008]本专利技术是在对其他动物LCs培养与纯化方法的基础上，采用酶消化、percoll密度梯度离心及差异贴壁等分离纯化方式结合，建立树鼩LCs原代培养和纯化的高效、简单方法，为利用树鼩开展相关研究提供新的实验材料；通过Zikv对LCs的感染特性研究，建立Zikv感染的睾丸细胞模型，为研究Zikv感染雄性生殖系统的相关研究提供实验基础。
[0009]本专利技术的技术方案具体如下：一种树鼩睾丸间质细胞的分离培养方法，按以下步骤进行：步骤一：分离；取出睾丸实质组织，清洗后将其剪碎后转入离心管内；加入1mg/mLIV胶原酶，放入CO2培养箱孵育30~35min，离心，加入0.25%胰酶消化10~15min后，用含血清的培养基终止消化，吸管吹打混匀，将细胞悬液放入细胞筛网中过滤，使之分散成单个细胞；收集到离心管中，离心，弃上清，加入DMEM/F12培养液重悬细胞，重复离心一次；步骤二：纯化；采用percoll密度梯度离心法：将分离得到的细胞悬液加于不同密度梯度的Percoll分离液上，从分离管底部向上密度依次为60%、37%、26%、21%，4℃、3000r/min离心30min；收集37%和60%之间的细胞，后用DMEM/F12培养液稀释，再将悬液以1500r/min离心10min，沉淀加入含胎牛血清的培养液，摇匀得细胞悬液；将分离纯化得到的细胞悬液计数，后稀释成1
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106个/m L浓度的细胞悬液，接种于培养瓶或培养板中CO2培养箱中培养，培养基配方为DMEM/F12培养基加10%FBS、1%青
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链霉素；此时细胞中还含有少量支持细胞和其他杂细胞，根据间质细胞和支持细胞贴壁时间不同，在传代后6h更换培养液以去除杂细胞达到纯化目的，第2代和第3代的细胞仍按此步骤进一步纯化。
[0010]进一步地，分离之前还进行以下操作：取3月龄的雄性树鼩，腹腔注射0.4ml 3%戊巴比妥钠麻醉处死后，无菌取出睾丸，75%乙醇中浸泡20 s，取出后用PBS冲洗两遍去乙醇。移入Heraguard ECO 超净工作台，去除睾丸的白膜、附睾及血管，小心取出睾丸实质组织，置于装有预冷D
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Hanks液的无菌培养皿中，洗涤2遍，去除血迹。
[0011]进一步地，在percoll密度梯度离心纯化的基础上，根据支持细胞和睾丸间质细胞的贴壁速度不同，通过差异贴壁的方法，在原代细胞贴壁6~12h换液，此方法操作至第3代可得到纯度高达98%的睾丸间质细胞，并能够快速增殖，具备基础的睾酮分泌能力。
[0012]进一步地，步骤一中，加入1mg/mLIV胶原酶，放入37℃、5% CO2培养箱孵育30~35min，1000r/min离心5min，加入0.25%胰酶消化10~15min后，用含血清的培养基终止消化，吸管吹打混匀，将细胞悬液放入40目细胞筛网中过滤，使之分散成单个细胞；收集到15mL离心管中，1000r/min离心5min，弃上清。
[0013]进一步地，步骤二中，从分离管底部向上密度依次为60%、37%、26%、21%，4℃、3000r/min离心30min；收集37%和60%之间的细胞，后用DMEM/F12培养液稀释，再将悬液以1500r/min离心10min，沉淀加入含胎牛血清的培养液，摇匀得细胞悬液；将分离纯化得到的细胞悬液计数，后稀释成1
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106个/m L浓度的细胞悬液，接种于培养瓶或培养板中37℃，5% CO2培养箱中培养，培养基配方为DMEM/F12培养基加10%FBS、1%青
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链霉素。
[0014]本专利技术还涉及的上述的方法制备的物质在制备治疗Zikv感染导致的雄性睾丸损伤及不育的药物中的应用。
[0015]本专利技术还涉及的一种治疗Zikv感染导致的雄性睾丸损伤及不育的药物，其特征在于：包括上述的方法制备的物质。
[0016]与现有技术相比，本专利技术的有益效果具体如下：本专利技术建立树鼩原代睾丸间质细胞（Leydig cells，LCs）分离培养方法，探究寨卡病毒（Zika virus，Zikv）对LCs的感染特性，为Zikv感染导致的雄性睾丸损伤及不育提供研究基础方法3月龄的雄性树鼩0.4ml 3%戊巴比妥钠麻醉处死后采集睾丸，采用IV胶原酶和胰蛋白酶联合消化法获得单细胞悬液。
[0017]通过采用percoll 密度梯度离心结合差异贴壁法对细胞进行纯化，3β
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种树鼩睾丸间质细胞的分离培养方法，其特征在于：按以下步骤进行：步骤一：分离；取出睾丸实质组织，清洗后将其剪碎后转入离心管内；加入1mg/mLIV胶原酶，放入CO2培养箱孵育30~35min，离心，加入0.25%胰酶消化10~15min后，用含血清的培养基终止消化，吸管吹打混匀，将细胞悬液放入细胞筛网中过滤，使之分散成单个细胞；收集到离心管中，离心，弃上清，加入DMEM/F12培养液重悬细胞，重复离心一次；步骤二：纯化；采用percoll密度梯度离心法：将分离得到的细胞悬液加于不同密度梯度的Percoll分离液上，从分离管底部向上密度依次为60%、37%、26%、21%，4℃、3000r/min离心30min；收集37%和60%之间的细胞，后用DMEM/F12培养液稀释，再将悬液以1500r/min离心10min，沉淀加入含胎牛血清的培养液，摇匀得细胞悬液；将分离纯化得到的细胞悬液计数，后稀释成1
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106个/m L浓度的细胞悬液，接种于培养瓶或培养板中CO2培养箱中培养，培养基配方为DMEM/F12培养基加10%FBS、1%青
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链霉素；此时细胞中还含有少量支持细胞和其他杂细胞，根据间质细胞和支持细胞贴壁时间不同，在传代后6h更换培养液以去除杂细胞达到纯化目的，第2代和第3代的细胞仍按此步骤进一步纯化。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：分离之前还进行以下操作：取3月龄的雄性树鼩，腹腔注射0.4ml 3%戊巴比妥钠麻醉处死后，无菌取出睾丸，75%乙醇中浸泡20 s，取出后用PBS冲洗两遍去乙醇；移入Heraguard ECO 超净工作台，去除睾丸的白膜、附睾及血管，小心取出睾丸实质组织，置于装有预冷D
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Hank...

【专利技术属性】
技术研发人员：代解杰，邓伟，罕园园，王文广，陆彩霞，李娜，孙晓梅，仝品芬，
申请(专利权)人：中国医学科学院医学生物学研究所，
类型：发明
国别省市：