代谢改造提升异源多杀菌素菌株发酵产量的方法技术

本发明专利技术公开了一种通过代谢改造提升异源多杀菌素菌株发酵产量的方法，属于合成生物学领域。提升聚酮化合物异源表达菌株聚酮化合物产量的方法，为利用在聚酮化合物异源表达菌株中可识别的强启动子替换聚酮合酶的启动子，启动子替换不破坏聚酮化合物基因簇的原操纵子为优，如果某个聚酮合酶表达量过少时可以破坏原操纵子；或者为增加聚酮化合物前体的供应。所述的聚酮化合物异源表达菌株为转有聚酮化合物基因簇的链霉菌。所述的聚酮化合物包括多杀菌素。本发明专利技术通过将多杀菌素的聚酮合酶的启动子用组成型强启动子进行替换和增加聚酮化合物前体的供应，使多杀菌素异源表达链霉菌的发酵产量由1mg/L提升到50mg/L。发酵产量由1mg/L提升到50mg/L。发酵产量由1mg/L提升到50mg/L。

【技术实现步骤摘要】
代谢改造提升异源多杀菌素菌株发酵产量的方法


[0001]本专利技术属于合成生物学领域，具体涉及通过代谢改造提升异源多杀菌素菌株发酵产量的方法。

技术介绍

[0002]聚酮化合物具有多种生理活性，可作为抗生素、抗肿瘤药物等，该类化合物大多数都有放线菌产生。但放线菌种类众多，很多放线菌难以实现遗传改造或者发酵放大，因此，常使用模式菌株作为异源宿主对聚酮化合物进行发酵生产，即将聚酮化合物基因簇转入模式菌株中，构建异源表达菌株，以期推进其产业化进程，但往往在异源菌株中得到的聚酮化合物的产量较低。
[0003]以聚酮化合物中的多杀菌素为例，多杀菌素作为仅次于阿维菌素的第二大杀虫剂，是目前被广泛使用的具有广谱杀虫活性的抗生素。因其具有高效、无残留、对人畜无害等优点而获得三次美国“总统绿色化学品挑战奖”，也是少数被欧盟批准可在有机作物上使用的杀虫剂。多杀菌素是一种被叫做刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)的放线菌所产生，该菌株于上世纪八十年代在维尔京群岛上一座甘蔗酿酒厂附近的土壤中首次被人们分离获得。然而，该菌遗传操作极其困难，发酵从种子到发酵周期长达22天，而且在发酵过程中极易发生污染，因此，为了规避该品种野生型菌种面临的遗传操作困难，发酵工艺不成熟的问题，申请人在前期已经进行了“多杀菌素异源表达”。多杀菌素的基因簇约90kb，按照功能可分为四部分：1)PKS基因：spnA、spnB、spnC、spnD、spnE，其中spnABC位于一个操纵子(operon)，spnDE位于一个操纵子；2)催化PKS环内C
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C键形成的基因：spnF、spnJ、spnL、spnM；3)福乐糖胺合成与加载：spnN、spnO、spnP、spnQ、spnR、spnS；4)鼠李糖基配体的加载与修饰：spnH、spnI、spnK、spnG。此外，还包括位于基因簇外的鼠李糖合成基因gtt、epi、gdh、kre。
[0004]申请人在前期研究中已经将多杀菌素在模式链霉菌Streptomyces albus J1074中实现异源表达，并将整个基因簇中表达较低的聚酮合酶spnE、鼠李糖合成相关基因(gtt，epi，gdh，kre，spnI)和福乐糖胺合成相关基因(spnO，spnN，spinQ，spnR，spnS)用强启动子进行过表达，得到多杀菌素异源菌株OE3，但摇瓶产量仅达到～1mg/L(TAN G Y,DENG K,LIU X,et al.2017.Heterologous Biosynthesis of Spinosad:An Omics
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Guided Large Polyketide Synthase Gene Cluster Reconstitution in Streptomyces[J].ACS Synth Biol,6(6):995
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1005.)。其余也有研究同样将多杀菌素的基因簇转入异源模式链霉菌S.albus J1074中，并且对基因簇进行了重排(SONG C,LUAN J,CUI Q,et al.2019.Enhanced Heterologous Spinosad Production from a 79
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kb Synthetic Multioperon Assembly[J].ACS Synth Biol,8(1):137
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147.)，该研究中的重排方式是将多杀菌素的基因簇划分为5个组，包括PKS聚合酶(SpnA
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SpnE)、聚酮交叉桥接基因(SpnJ，spnM，spnF，spnI)、鼠李糖合成基因(gtt，gdh，epi，kre)、鼠李糖甲基化(spnI，spnK，spnH)和福乐糖胺转移酶(spnP)、福乐糖胺合成基因(spnO，spnN，spnQ，spnR)和甲基化基因
(spnS)，在每个组的基因上都替换了一个强组成型的启动子，但得到的菌株的摇瓶发酵产量也仍然在1mg/L上下，离产业化尚有很长距离。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于克服现有技术存在的缺点与不足，提供一种提升聚酮化合物异源表达菌株聚酮化合物产量的方法。本专利技术的另一目的在于提供一种提升多杀菌素异源表达链霉菌多杀菌素产量的方法。本专利技术的再一目的在于提供一种高产多杀菌素的菌株。
[0006]本专利技术的目的通过下述技术方案实现：
[0007]一种提升聚酮化合物异源表达菌株聚酮化合物产量的方法，为利用在聚酮化合物异源表达菌株中可识别的强启动子替换聚酮合酶的启动子。所述的聚酮化合物异源表达菌株为转有聚酮化合物基因簇的链霉菌。该方法中，启动子替换不是随意替换，以不破坏聚酮化合物基因簇的原操纵子(operon)为优；但如果某个聚酮合酶表达量过少，可以破坏原操纵子，用强启动子进行该基因的单独过表达。
[0008]一种提升聚酮化合物异源表达菌株聚酮化合物产量的方法，为增加聚酮化合物前体的供应。所述的聚酮化合物前体包括丙二酰辅酶A、甲基丙二酰辅酶A、乙酰辅酶A和丙酰辅酶A等。增加聚酮化合物亲体的供应采用过表达乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、丙酰辅酶A羧化酶(PCC)和乙酰辅酶A合成酶(AcsA2)基因，可以增加丙二酰辅酶A、甲基丙二酰辅酶A、乙酰辅酶A和丙酰辅酶A的供应。
[0009]上述聚酮化合物包括多杀菌素。
[0010]一种提升多杀菌素异源表达链霉菌多杀菌素产量的方法，为将多杀菌素的聚酮合酶的启动子用组成型强启动子进行替换。所述的多杀菌素的聚酮合酶的启动子包括spnA、spnB、spnC、spnD、spnE的启动子；所述的组成型强启动子包括rpsLp
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Cf、rpsLp
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TP、kasOp、kasOp
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rpslp
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cf、SPL44、SRL39、SPL42、SRL23、SPL39、SRL37、SRL15、KsaOP
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kinase等。
[0011]一种提升多杀菌素异源表达链霉菌多杀菌素产量的方法，为在多杀菌素异源表达链霉菌中过表达乙酰辅酶A羧化酶、丙酰辅酶A羧化酶和乙酰辅酶A合成酶基因中的一种或多种。
[0012]一种高产多杀菌素的菌株，为下述菌株中的一种：
[0013](1)将多杀菌素异源表达链霉菌spnA基因的启动子替换为强启动子得到的菌株；
[0014](2)将多杀菌素异源表达链霉菌spnA基因和spnD基因的启动子替换为强启动子得到的菌株；
[0015](3)将多杀菌素异源表达链霉菌spnA基因、spnD基因和spnC基因的启动子替换为强启动子得到的菌株；
[0016](4)将多杀菌素异源表达链霉菌spnA基因、spnD基因、spnC基因和spnB基因的启动子替换为强启动子得到的菌株；
[0017](5)过表达丙酰辅酶A羧化酶、乙酰辅酶A合成酶的菌株(2)；
[0018](6)过表达丙酰辅酶A羧化酶、乙酰辅酶A羧化酶和乙酰本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提升聚酮化合物异源表达菌株聚酮化合物产量的方法，其特征在于：所述的方法为利用在聚酮化合物异源表达菌株中可识别的强启动子替换聚酮合酶的启动子；所述的聚酮化合物异源表达菌株为转有聚酮化合物基因簇的链霉菌。2.根据权利要求1所述的提升聚酮化合物异源表达菌株聚酮化合物产量的方法，其特征在于：启动子替换不破坏聚酮化合物基因簇的原操纵子。3.根据权利要求1所述的提升聚酮化合物异源表达菌株聚酮化合物产量的方法，其特征在于：如果某个聚酮合酶表达量过少，可以破坏原操纵子，用强启动子进行该基因的单独过表达。4.一种提升聚酮化合物异源表达菌株聚酮化合物产量的方法，其特征在于：所述的方法为增加聚酮化合物前体的供应；所述的聚酮化合物前体包括丙二酰辅酶A、甲基丙二酰辅酶A、乙酰辅酶A和丙酰辅酶A。5.根据权利要求4所述的提升聚酮化合物异源表达菌株聚酮化合物产量的方法，其特征在于：增加聚酮化合物前体的供应采用过表达乙酰辅酶A羧化酶、丙酰辅酶A羧化酶和乙酰辅酶A合成酶基因，增加丙二酰辅酶A、甲基丙二酰辅酶A、乙酰辅酶A和丙酰辅酶A的供应。6.根据权利要求1
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5任一项所述的提升聚酮化合物异源表达菌株聚酮化合物产量的方法，其特征在于：所述的聚酮化合物包括多杀菌素。7.一种提升多杀菌素异源表达链霉菌多杀菌素产量的方法，其特征在于：所述的方法为将多杀菌素的聚酮合酶的启动子用组成型强启动子进行替换。8.根据权利要求7所述的提升多杀菌素异源表达链霉菌多杀菌素产量...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘天罡，刘然，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：