测量25-羟基维生素D的试剂和测量25-羟基维生素D的方法技术

本发明专利技术解决了提供测量25

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】测量25
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羟基维生素D的试剂和测量25
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羟基维生素D的方法


[0001]本专利技术涉及测量25
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羟基维生素D的试剂和测量25
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羟基维生素D的方法。特别地，本专利技术涉及测量25
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羟基维生素D的试剂和测量25
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羟基维生素D方法，所述试剂和方法基于竞争性免疫测定。

技术介绍

[0002]维生素D是一种重要的物质，在人和动物体的生物过程中具有许多意义。已知具有生理活性的维生素D调节肠道对钙的吸收，尤其是骨钙化。它还具有提高血清钙浓度的作用。已知维生素D缺乏或过量会产生各种后果，尤其是已知维生素D缺乏会导致严重的疾病，例如骨质疏松症和佝偻病。因此，体内维生素D的定量对于揭示潜在的缺乏或过量非常重要。
[0003]维生素D以两种形式存在于生物体中，即维生素D2(麦角钙化醇)和维生素D3(胆钙化醇)，如图1所示。
[0004]维生素D2是从食物中获得的外源性维生素D，维生素D3是太阳紫外线作用于皮肤而产生的内源性维生素D。这些维生素D与维生素D结合蛋白结合并通过该蛋白转运至肝脏，在肝脏中25位的碳被羟基化以形成25
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羟基维生素D(25(OH)VD)。此外，在肾脏中，它们中的一些的1位的碳被羟基化以产生活性形式1,25(OH)2VD。
[0005]将参照图1描述在生物体内发生的上述维生素D的两步代谢。第一步，维生素D2或维生素D3被代谢成25
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羟基维生素D2或25
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羟基维生素D3(以下有时分别称为25(OH)VD2和25(OH)VD3)。这些统称为25
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羟基维生素D(以下有时称为25(OH)VD))。然后，25(OH)VD2或25(OH)VD3被代谢成1,25
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二羟基维生素D2或1,25
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二羟基维生素D3(以下有时分别简称为1,25(OH)2D2和1,25(OH)2D3，并统称为1,25(OH)2VD)。
[0006]在这些代谢物中，稳定的25(OH)VD是一个有用的指标，因为它很好地反映了血液中维生素D的充足性。
[0007]在此，已知以下方法作为测量25(OH)VD的方法。
[0008]已知“Lumipulse(注册商标)25
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羟基维生素D”作为通过化学发光酶免疫测定(CLEIA)测量血清或血浆中的25(OH)VD的方法的试剂。本方法是通过测量酶促反应的发光量来测量样品中25(OH)VD浓度的方法，所述酶促反应通过第一反应和第二反应进行，所述第一反应是与抗25(OH)VD单克隆抗体结合的铁氧体颗粒和样品中的25(OH)VD形成免疫复合物，第二反应是与上述复合物和酶标抗25(OH)VD免疫复合物单克隆抗体形成免疫复合物。本方法在第一次反应之后和第二次反应之后需要洗涤步骤，并且是一个复杂的过程。
[0009]此外，专利文献1公开了使用一次性锥体(cone)的25(OH)VD的免疫测定。在该方法中，将预处理的样品与酶标抗维生素D抗体在孔中混匀，孵育，然后转移到固定维生素D的锥体中，并进一步孵育。在此期间，样品中的抗原25(OH)VD和固定在锥体上的维生素D竞争酶标抗维生素D抗体的抗体位点，固定在锥体上的维生素D和酶标抗维生素D抗体的复合物可以通过洗涤去除未固定化的产物来检测。由于复合物的浓度与样品中的抗原浓度成反比，
因此可以计算出样品中的25(OH)VD。然而，本方法也需要洗涤步骤，并且是如上所述的复杂过程。
[0010]引用列表
[0011]专利文献
[0012]专利文献1：PCT国际申请公开号2016
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531306的日文翻译

技术实现思路

[0013]技术问题
[0014]如上所述，用于测量25(OH)VD的常规方法是一个复杂的过程，并且没有基于胶乳比浊免疫测定的方法，这是一种不需要洗涤步骤的均质测量方法。
[0015]胶乳比浊免疫测定(以下，有时称为LTIA)是使用固定有抗原或抗体的胶乳颗粒来测量测试物质的方法，广泛用于临床检验领域。LTIA大致可分为以下方法：使固定有针对测试物质的抗体的胶乳颗粒与作为测试物质的抗原反应，以形成夹心型免疫复合物，和从与形成免疫复合物相关的胶乳颗粒的凝集程度测量测试物质(抗原)(以下有时称为夹心LTIA)，以及抑制胶乳颗粒与抗原(测试物质)之间形成免疫复合物的方法，其通过在存在固定有抗体的胶乳颗粒的情况下，合成抗原与测试样品中的抗原(测试物质)之间的竞争，并从与抑制免疫复合物形成相关的胶乳颗粒的凝集(凝集抑制)的抑制程度测量测试物质(抗原)(以下有时称为竞争性LTIA等)。
[0016]本专利技术解决了提供通过竞争性LTIA测量25(OH)VD的方法和测量试剂的问题。此外，本专利技术还解决了提供测量25(OH)VD的方法和测量试剂的问题，该方法和试剂不仅基于竞争性LTIA，而且还基于竞争性免疫测定。
[0017]问题的解决方案
[0018]本专利技术人制备了一种多价抗原，其中两个或多个25(OH)VD在竞争性LTIA中与载体如蛋白质结合，并研究了通过竞争性LTIA进行的测量，其中当25(OH)VD在血中浓度为零时发生最大的凝集，且凝集量随血中25(OH)VD浓度的增加而降低。即，专利技术人研究了使用双试剂试剂盒的测量系统，该双试剂试剂盒在第一试剂中包含多价抗原，在第二试剂中包含抗25(OH)VD抗体致敏胶乳。在此，当将作为测量目标的25(OH)VD衍生为多价抗原时，检测灵敏度不够令人满意。但是，本专利技术人发现，当将与待测的25(OH)VD不同的通过衍生化化学式(I)表示的维生素D获得的结构用作竞争性多价抗原时，测量灵敏度惊人地提高。
[0019]此外，本专利技术人发现该发现的作用不仅限于竞争性LTIA，还可以应用于竞争性免疫测定，从而完成了本专利技术。
[0020]更具体地说，本专利技术具有以下组成：
[0021]<1>
[0022]基于竞争性免疫测定测量25
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羟基维生素D的试剂，其包括至少以下组分：
[0023](1)下述化学式(I)和/或(II)表示的维生素D衍生物；和
[0024](2)抗25羟基维生素D抗体，
[0025][式1][0026][0027][式2][0028][0029]其中A代表能够以高亲和力与载体化学结合的示踪基团，和
[0030]X表示链长为3至20的烃基，其未被取代或被杂原子取代。
[0031]<2>
[0032]根据<1>所述的测量25
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羟基维生素D的试剂，其中，所述A选自氨基、羧基、巯基、生物素、地高辛配基(digoxygenin)、酪氨酸、FITC
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取代的酪氨酸、取代的氨基酸、氨基酸和肽序列本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.基于竞争性免疫测定测量25
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羟基维生素D的试剂，其包括至少以下组分：(1)下述化学式(I)和/或(II)表示的维生素D衍生物；和(2)抗25羟基维生素D抗体，[式1][式2]其中A代表能够以高亲和力与载体化学结合的示踪基团，和X表示链长为3至20的烃基，其未被取代或被杂原子取代。2.根据权利要求1所述的测量25
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羟基维生素D的试剂，其中，所述A选自氨基、羧基、巯基、生物素、地高辛配基、酪氨酸、FITC
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取代的酪氨酸、取代的氨基酸、氨基酸和肽序列、FITC、蛋白质和肽、A蛋白、G蛋白和维生素D衍生物。3.根据权利要求1或2所述的测量25
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羟基维生素D的试剂，其中，化学式(I)或(II)表示的所述维生素D衍生物处于这样的构型，其中两个或多个分子通过A与载体结合并形成多价抗原。4.根据权利要求1至3中任一项所述的测量25
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羟基维生素D的试剂，其中，所述竞争性免疫测定的测量原理为选自RIA、EIA、LTIA和CLEIA的竞争性免疫测定。5.根据权利要求4所述的测量25
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羟基维生素D的试剂，其中，所述竞争性免疫测定为竞争性胶乳比浊免疫测定(竞争性LTIA)。
6.根据权利要求1至5任一项所述的测量25
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羟基维生素D的试剂，其中，所述25
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羟基维生素D为25
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羟基维生素D2和25
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羟基维生素D3之和，所述维生素D衍生物为维生素D2衍生物和/或维生素D3衍生物，并且所述抗25
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羟基维生素D抗体为抗25
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羟基维生素D2和/或抗25
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羟基维生素D3抗体。7.根据权利要求1至6中任一项所述的测量25
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羟基维生素D的试剂，其中，所述维生素D3衍生物为下述化学式(III)表示的化合物：[式3]8.根据权利要求1至7中任一项所述的测量25
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羟基维生素D的试剂，其中，(1)或(2)中的任一个被固定在不溶性载体上。9.根据权利要求1至8中任一项所述的测量25
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羟基维生素D的试剂，其为用于自动分析仪的试剂。10.基于竞争性免疫测定测量25
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羟基维生素D的方法，其包括至少以下步骤：(1)在化学式(I)和/或(II)表示的维生素D衍生物存在下使样品与抗25
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羟基维生素D抗体接触的...

【专利技术属性】
技术研发人员：山本光章，大田美惠子，西尾朋久，
申请(专利权)人：积水医疗株式会社，
类型：发明
国别省市：