【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】靶向CEBP/
β
的细胞外囊泡
‑
ASO构建体
[0001]通过EFS
‑
WEB以电子方式提交的序列表的引用
[0002]与本申请一起提交的以ASCII文本文件(名称：4000_058PC07_Seqlisting_ST25.txt；大小：280,024字节；以及创建日期：2020年8月13日)以电子方式提交的序列表的内容以引用的方式整体并入本文。
[0003]相关申请的交叉引用
[0004]本PCT申请要求2019年8月14日提交的美国临时申请号62/886,930；2019年9月13日提交的美国临时申请号62/900,136；2019年11月15日提交的美国临时申请号62/936,220；2019年12月5日提交的美国临时申请号62/944,204；2020年3月13日提交的美国临时申请号62/989,540；2020年5月11日提交的美国临时申请号63/023,065；2020年6月5日提交的美国临时申请号63/035,357的优先权，所述临时申请各自以引用的方式整体并入本文。
[0005]本公开涉及包含反义寡核苷酸(ASO)的细胞外囊泡(EV)(例如，外泌体)，其中所述ASO包含长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列与CEBP/β转录物内的核酸序列互补。在本公开的某些方面中，所述细胞外囊泡还包含支架蛋白。
技术介绍
[0006]外泌体是由每个真核细胞天然产生的小的细胞外囊泡。外泌体包含封闭内部空间(即，
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种包含反义寡核苷酸(ASO)的细胞外囊泡，所述反义寡核苷酸(ASO)包含长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列与CEBP/β转录物(SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:13)内的核酸序列互补。2.如权利要求1所述的细胞外囊泡，其中所述ASO不是TGGATTTAAAGGCAGGCGGC(SEQ ID NO:90)。3.如权利要求1或2所述的细胞外囊泡，所述细胞外囊泡靶向选自由以下组成的组的细胞：巨噬细胞、骨髓源性抑制细胞(MDSC)、单核细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞以及它们的任何组合。4.如权利要求1至3中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述ASO包含长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列与对应于如SEQ ID NO:13中列出的核苷酸序列的CEBP/β转录物的核苷酸1至518或对应于如SEQ ID NO:13中列出的核苷酸序列的CEBP/β转录物的核苷酸521至2113内的核酸序列互补。5.如权利要求4所述的细胞外囊泡，其中所述连续核苷酸序列与所述CEBP/β转录物内的所述核酸序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％互补。6.如权利要求1至5中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述ASO能够降低人细胞(例如，免疫细胞)中的CEBP/β蛋白表达，其中所述人细胞表达所述CEBP/β蛋白。7.如权利要求6所述的细胞外囊泡，其中与未暴露于所述ASO的人细胞中的CEBP/β蛋白表达相比，所述CEBP/β蛋白表达降低至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％。8.如权利要求1至7中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述ASO能够降低人细胞(例如，免疫细胞)中的CEBP/βmRNA的水平，其中所述人细胞表达所述CEBP/βmRNA。9.如权利要求8所述的细胞外囊泡，其中与未暴露于所述ASO的人细胞中的所述CEBP/βmRNA的水平相比，CEBP/βmRNA的所述水平降低至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％。10.如权利要求1至9中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述ASO是间隙聚体、混合聚体或全聚体。11.如权利要求1至10中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述ASO包含一种或多种核苷类似物。12.如权利要求11所述的细胞外囊泡，其中所述核苷类似物中的一者或多者包括2'
‑
O
‑
烷基
‑
RNA；2'
‑
O
‑
甲基RNA(2'
‑
OMe)；2'
‑
烷氧基
‑
RNA；2'
‑
O
‑
甲氧基乙基
‑
RNA(2'
‑
MOE)；2'
‑
氨基
‑
DNA；2'
‑
氟
‑
RNA；2'
‑
氟
‑
DNA；阿拉伯核酸(ANA)；2'
‑
氟
‑
ANA；或双环核苷类似物。13.如权利要求11或12所述的细胞外囊泡，其中所述核苷类似物中的一者或多者是糖修饰的核苷。14.如权利要求13所述的细胞外囊泡，其中所述糖修饰的核苷是增强亲和力的2'糖修饰的核苷。15.如权利要求11至14中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述核苷类似物中的一者或多者包括包含双环糖的核苷。
16.如权利要求11至14中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述核苷类似物中的一者或多者包括LNA。17.如权利要求11至16中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述核苷酸类似物中的一者或多者选自由以下组成的组：限制性乙基核苷(cEt)、2',4'
‑
限制性2'
‑
O
‑
甲氧基乙基(cMOE)、α
‑
L
‑
LNA、β
‑
D
‑
LNA、2'
‑
O,4'
‑
C
‑
亚乙基
‑
桥联核酸(ENA)、氨基
‑
LNA、氧基
‑
LNA、硫代
‑
LNA以及它们的任何组合。18.如权利要求1至17中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述ASO包含一个或多个5'
‑
甲基
‑
胞嘧啶核碱基。19.如权利要求10至18中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述连续核苷酸序列与所述CEBP/β转录物的(i)5'非翻译区(UTR)；(ii)编码区；或(iii)3'UTR内的核酸序列互补。20.如权利要求1至19中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述连续核苷酸序列与包含(i)SEQ ID NO:13的核苷酸1
–
600；(ii)SEQ ID NO:13的核苷酸100
–
600；(iii)SEQ ID NO:13的核苷酸200
–
600；(iv)SEQ ID NO:13的核苷酸300
–
600；(v)SEQ ID NO:13的400
–
600；(vi)SEQ ID NO:13的核苷酸500
–
1000；(vii)SEQ ID NO:13的核苷酸900
–
1200；(viii)SEQ ID NO:13的核苷酸1000
–
1300；(ix)SEQ ID NO:13的核苷酸1300
–
1500；(x)SEQ ID NO:13的489
–
649；(xi)SEQ ID NO:13的核苷酸594
–
728；(xii)SEQ ID NO:13的核苷酸765
–
700；(xiii)SEQ ID NO:13的核苷酸936
–
1076；(xiv)SEQ ID NO:13的核苷酸999
–
2068；(xv)SEQ ID NO:13的1203
–
1357；(xvi)SEQ ID NO:13的核苷酸1355
–
1487；(xvii)SEQ ID NO:13的529
–
609；(xviii)SEQ ID NO:13的核苷酸634
–
688；(xix)SEQ ID NO:13的核苷酸805
‑
700；(xx)SEQ ID NO:13的核苷酸976
–
1036；(xxi)SEQ ID NO:13的核苷酸1039
–
2028；(xxii)SEQ ID NO:13的1243
–
1317；或(xxiii)SEQ ID NO:13的核苷酸1395
–
1447的核酸序列互补。21.如权利要求1至20中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述连续核苷酸序列与(i)SEQ ID NO:13的539
–
599；(ii)SEQ ID NO:13的核苷酸644
–
678；(iii)SEQ ID NO:13的核苷酸815
–
690；(iv)SEQ ID NO:13的核苷酸986
–
1026；(v)SEQ ID NO:13的核苷酸1049
–
2018；(vi)SEQ ID NO:13的1253
–
1307；或(vii)SEQ ID NO:13的核苷酸1405
–
1437内的核酸序列互补。22.如权利要求1至21中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述连续核苷酸序列包含与选自图1中的序列的序列互补的核苷酸序列。23.如权利要求14至22中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述连续核苷酸序列与所述CEBP/β转录物内的核苷酸序列完全互补。24.如权利要求13至31中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述ASO包含选自SEQ ID NO:194
‑
296的核苷酸序列，具有一个或两个错配。25.如权利要求1至24中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述ASO具有选自由图1中的设计组成的组中的设计，其中大写字母是糖修饰的核苷，并且小写字母是DNA。26.如权利要求1至25中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述ASO的长度是14至20个核苷酸。27.如权利要求4至26中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述连续核苷酸序列包含一个或多个经修饰的核苷间键联。28.如权利要求35所述的细胞外囊泡，其中所述一个或多个经修饰的核苷间键联是硫
代磷酸酯键联。29.如权利要求27或28所述的细胞外囊泡，其中至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％的核苷间键联经修饰。30.如权利要求29所述的细胞外囊泡，其中所述ASO中的所述核苷间键联中的每一者是硫代磷酸酯键联。31.如权利要求1至30中任一项所述的细胞外囊泡，所述细胞外囊泡还包含锚定部分。32.如权利要求31所述的细胞外囊泡，其中所述ASO连接至所述锚定部分。33.如权利要求1至32中任一项所述的细胞外囊泡，所述细胞外囊泡还包含外源靶向部分。34.如权利要求33所述的细胞外囊泡，其中所述外源靶向部分包含肽、抗体或其抗原结合片段、化学化合物、RNA适体或它们的任何组合。35.如权利要求33或34所述的细胞外囊泡，其中所述外源靶向部分包含肽。36.如权利要求33至35中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述外源靶向部分包含微蛋白、设计的锚蛋白重复蛋白(darpin)、抗运载蛋白、adnectin、适体、肽模拟物分子、受体的天然配体、骆驼科动物纳米抗体或它们的任何组合。37.如权利要求33至36中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述外源靶向部分包含全长抗体、单结构域抗体、仅重链抗体(VHH)、单链抗体、仅鲨鱼重链抗体(VNAR)、scFv、Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或它们的任何组合。38.如权利要求37所述的细胞外囊泡，其中所述抗体是单链抗体。39.如权利要求33至38中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述外源靶向部分使外泌体靶向肝脏、心脏、肺、脑、肾脏、中枢神经系统、周围神经系统、肌肉、骨、关节、皮肤、肠、膀胱、胰腺、淋巴结、脾脏、血液、骨髓或它们的任何组合。40.如权利要求33至39中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述外源靶向部分使所述外泌体靶向肿瘤细胞、树突细胞、T细胞、B细胞、巨噬细胞、神经元、肝细胞、库普弗细胞、髓系细胞(例如，嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、造血干细胞、MDSC(例如，单核细胞性MDSC或粒细胞性MDSC))或它们的任何组合。41.如权利要求33至40中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述EV包含将所述外源靶向部分连接至所述EV的支架部分。42.如权利要求33至41中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述锚定部分和/或所述支架部分是支架X。43.如权利要求33至41中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述锚定部分和/或所述支架部分是支架Y。44.如权利要求42所述的细胞外囊泡，其中所述支架X是能够将所述ASO锚定在所述EV的腔表面上和/或所述EV的外表面上的支架蛋白。45.如权利要求42或44所述的细胞外囊泡，其中所述支架X选自由以下组成的组：前列腺素F2受体负调控因子(PTGFRN蛋白)；basigin(BSG蛋白)；免疫球蛋白超家族成员2(IGSF2蛋白)；免疫球蛋白超家族成员3(IGSF3蛋白)；免疫球蛋白超家族成员8(IGSF8蛋白)；整联蛋白β
‑
1(ITGB1蛋白)；整联蛋白α
‑
4(ITGA4蛋白)；4F2细胞表面抗原重链(SLC3A2蛋白)；一类ATP转运蛋白(ATP1A1、ATP1A2、ATP1A3、ATP1A4、ATP1B3、ATP2B1、ATP2B2、ATP2B3、ATP2B4
蛋白)；它们的功能片段；以及它们的任何组合。46.如权利要求31至45中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述锚定部分和/或所述支架部分是PTGFRN蛋白或其功能片段。47.如权利要求31至46中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述锚定部分和/或所述支架部分包含如SEQ ID NO:302中列出的氨基酸序列。48.如权利要求31至47中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述锚定部分和/或所述支架部分包含与SEQ ID NO:301至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或约100％同一的氨基酸序列。49.如权利要求43所述的细胞外囊泡，其中所述支架Y是能够将所述ASO锚定在所述EV的腔表面上和/或所述EV的外表面上的支架蛋白。50.如权利要求43或49所述的细胞外囊泡，其中所述支架Y选自由以下组成的组：富含肉豆蔻酰化丙氨酸的蛋白激酶C底物(MARCKS蛋白)、富含肉豆蔻酰化丙氨酸的蛋白激酶C底物样1(MARCKSL1蛋白)、脑酸溶性蛋白1(BASP1蛋白)、它们的功能片段以及它们的任何组合。51.如权利要求43、49和50中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述支架Y是BASP1蛋白或其功能片段。52.如权利要求43和49至51中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述支架Y包含N末端结构域(ND)和效应结构域(ED)，其中所述ND和/或所述ED与所述EV的所述腔表面缔合。53.如权利要求52所述的细胞外囊泡，其中所述ND通过肉豆蔻酰化与所述外泌体的所述腔表面缔合。54.如权利要求52或53所述的细胞外囊泡，其中所述ED通过离子相互作用与所述外泌体的所述腔表面缔合。55.如权利要求52至53中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述ED包含(i)碱性氨基酸或(ii)按顺序的两个或更多个碱性氨基酸，其中所述碱性氨基酸选自由以下组成的组：Lys、Arg、His以及它们的任何组合。56.如权利要求55所述的细胞外囊泡，其中所述碱性氨基酸是(Lys)n，其中n是介于1与10之间的整数。57.如权利要求52至56中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述ED包含Lys(K)、KK、KKK、KKKK(SEQ ID NO:405)、KKKKK(SEQ ID NO:406)、Arg(R)、RR、RRR、RRRR(SEQ ID NO:407)、RRRRR(SEQ ID NO:408)、KR、RK、KKR、KRK、RKK、KRR、RRK、(K/R)(K/R)(K/R)(K/R)(SEQ ID NO:409)、(K/R)(K/R)(K/R)(K/R)(K/R)(SEQ ID NO:410)或它们的任何组合。58.如权利要求52至57中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述ND包含如G:X2:X3:X4:X5:X6中列出的氨基酸序列，其中G表示Gly；其中“:”表示肽键，其中所述X2至所述X6中的每一者独立地是氨基酸，并且其中所述X6包含碱性氨基酸。59.如权利要求58所述的细胞外囊泡，其中：(i)所述X2选自由以下组成的组：Pro、Gly、Ala和Ser；(ii)所述X4选自由以下组成的组：Pro、Gly、Ala、Ser、Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Gln和Met；(iii)所述X5选自由以下组成的组：Pro、Gly、Ala和Ser；
(iv)所述X6选自由以下组成的组：Lys、Arg和His；或(v)(i)
‑
(iv)的任何组合。60.如权利要求52至59中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述ND包含G:X2:X3:X4:X5:X6的氨基酸序列，其中(i)G代表Gly；(ii)“:”表示肽键；(iii)所述X2是选自由以下组成的组的氨基酸：Pro、Gly、Ala和Ser；(iv)所述X3是氨基酸；(v)所述X4是选自由以下组成的组的氨基酸：Pro、Gly、Ala、Ser、Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Gln和Met；(vi)所述X5是选自由以下组成的组的氨基酸：Pro、Gly、Ala和Ser；并且(vii)所述X6是选自由以下组成的组的氨基酸：Lys、Arg和His。61.如权利要求58至60中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述X3选自由以下组成的组：Asn、Gln、Ser、Thr、Asp、Glu、Lys、His和Arg。62.如权利要求52至61中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述ND和所述ED通过接头连接。63.如权利要求62所述的细胞外囊泡，其中所述接头包含一个或多个氨基酸。64.如权利要求52至63中任一项所述的方法，其中所述ND包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(i)GGKLSKK(SEQ ID NO:411)、(ii)GAKLSKK(SEQ ID NO:412)、(iii)GGKQSKK(SEQ ID NO:413)、(iv)GGKLAKK(SEQ ID NO:414)、(v)GGKLSK(SEQ ID NO:415)或(vi)它们的任何组合。65.如权利要求64所述的细胞外囊泡，其中所述ND包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(i)GGKLSKKK(SEQ ID NO:438)、(ii)GGKLSKKS(SEQ ID NO:439)、(iii)GAKLSKKK(SEQ ID NO:440)、(iv)GAKLSKKS(SEQ ID NO:441)、(v)GGKQSKKK(SEQ ID NO:442)、(vi)GGKQSKKS(SEQ ID NO:443)、(vii)GGKLAKKK(SEQ ID NO:444)、(viii)GGKLAKKS(SEQ ID NO:445)和(ix)它们的任何组合。66.如权利要求52至65中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述ND包含氨基酸序列GGKLSKK(SEQ ID NO:411)。67.如权利要求43和49至66中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述支架Y的长度是至少约8、至少约9、至少约10、至少约11、至少约12、至少约13、至少约14、至少约15、至少约16、至少约17、至少约18、至少约19、至少约20、至少约21、至少约22、至少约23、至少约24、至少约25、至少约30、至少约35、至少约40、至少约45、至少约50、至少约55、至少约60、至少约65、至少约70、至少约75、至少约80、至少约85、至少约90、至少约95、至少约100、至少约105、至少约110、至少约120、至少约130、至少约140、至少约150、至少约160、至少约170、至少约180、至少约190或至少约200个氨基酸。68.如权利要求43和49至67所述的细胞外囊泡，其中所述支架Y包含(i)GGKLSKKKKGYNVN(SEQ ID NO:446)、(ii)GAKLSKKKKGYNVN(SEQ ID NO:447)、(iii)GGKQSKKKKGYNVN(SEQ ID NO:448)、(iv)GGKLAKKKKGY...
【专利技术属性】
技术研发人员：达利亚，
申请(专利权)人：科迪亚克生物科学公司，
类型：发明
国别省市：
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