一种干细胞专用胎牛血清的筛选工艺制造技术

本发明专利技术提供了一种干细胞专用胎牛血清的筛选工艺。该方法基于细胞学实验技术获得了细胞平均扩增密度、细胞平均倍增时间、克隆形成量等检测参数综合评价筛选适用于间充质干细胞培养的胎牛血清，建立了一个间充质干细胞培养用胎牛血清评价模型和适用度评价表。通过适用度评价表和评价模型，快速准确筛选出适用于多种来源间充质干细胞培养的胎牛血清。多种来源间充质干细胞培养的胎牛血清。多种来源间充质干细胞培养的胎牛血清。

Screening process of fetal bovine serum for stem cells

【技术实现步骤摘要】
一种干细胞专用胎牛血清的筛选工艺


[0001]本专利技术涉及血清筛选
，具体为一种干细胞专用胎牛血清的筛选工艺。

技术介绍

[0002]间充质干细胞具有多谱系分化的能力，产生多种间充质表型，可以分化为神经细胞、心脏细胞、肝脏细胞、骨细胞、软骨细胞、肌腱细胞、脂肪细胞和上皮细胞等多种细胞。这种细胞多向分化的能力给人类多种疾病的治疗提供了重要基础，在基因细胞治疗、组织缺损修复等方面有较好应用前景。利用胎牛血清培养间充质干细胞已经有几十年的历史，然而作为一种天然产物，胎牛血清的组成非常复杂，且因动物个体、饲养地域和管理水平差异，导致胎牛血清产品批次间有较大差异，甚至因病毒微生物感染、生产工艺波动等，使产品中出现对细胞培养有害成分。因而，往往科研机构或企业无法直接购买使用或替换胎牛血清用于间充质干细胞培养，通常需要大量时间，从若干多个批号的胎牛血清产品中进行筛选，以确认获得适用于间充质干细胞培养的胎牛血清批号。而基于细胞学技术开展的各种为胎牛血清适用性评价的实验，常常都会遇到结果波动大，实验稳定性不好，各评价指标之间一致性不高等问题。同时因为缺乏胎牛血清适用评价的行业标准，只能进行相对不同批次胎牛血清之间的平行比较，而无法合理评价非平行比较中的不同批次胎牛血清。本专利技术建立了一种高效的血清筛选评价方法，通过适用度评价表和评价模型，快速准确筛选出适用于多种来源间充质干细胞培养的胎牛血清。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于提供一种干细胞专用胎牛血清的筛选工艺，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
[0004]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0005]一种干细胞专用胎牛血清的筛选工艺，所述筛选工艺包括以下步骤：
[0006](1)取待测血清，检测待测血清的细胞平均扩增密度、细胞平均倍增时间、克隆形成量；
[0007](2)将步骤(1)得到的待测血清的细胞平均扩增密度、细胞平均倍增时间、克隆形成量，代入适用性指数计算模型计算得到适用性指数，具体计算模型为：
[0008][0009]其中：yks_Index:适用性指数；
[0010]Ds：待测血清培养后的细胞平均倍增时间；
[0011]Dc：标准血清培养后的细胞平均倍增时间；
[0012]Ps：待测血清培养后的细胞平均扩增密度；
[0013]Pc：标准血清培养后的细胞平均扩增密度；
[0014]Cs：待测血清培养后的克隆形成量；
[0015]Cc：标准血清培养后的克隆形成量；
[0016](3)根据步骤(2)中计算出的适用性指数进行待测血清评价，并根据评价结果进行筛选，当1≤适用性指数≤4时，其对应的待测血清评价为不适用，当5≤适用性指数≤7时，其对应的待测血清评价为合格，当8≤适用性指数≤10时，其对应的待测血清评价为优。
[0017]进一步的，所述步骤(1)包括以下操作步骤：
[0018]a.细胞悬液制备：
[0019]Ⅰ.取间充质干细胞复苏，接种至T25细胞培养瓶中，传代扩增，当间充质干细胞长到汇合度达80
‑
90％时，用胰酶消化，加入新鲜完全DMEM培养基吹打，转移至离心管中，离心去上清，离心去上清时的工作参数为：1200rpm下离心5min，加入新鲜DMEM基础培养基制备成细胞悬液；
[0020]Ⅱ.取待测血清，加入DMEM基础培养基中配置待测血清培养基；
[0021]b.细胞增殖：向6孔板每孔中加入待测血清培养基，设置复孔，每孔取细胞悬液接种，晃匀置于培养箱中培养48h，用胰酶将细胞消化并计数，然后接种间充质干细胞至新的6孔板中，重复以上操作，共培养三到五代，计算待测血清培养后的细胞平均扩增密度；
[0022]c.细胞倍增时间：取细胞悬液加入待测血清培养基，调整细胞终浓度，向24孔板的12 个孔中加入终浓度细胞悬液，设置复孔，分别在第1到7天消化细胞并计数，每天3个复孔，每隔24h用胰酶消化，将细胞记数，根据计数结果绘制生长曲线，取出现峰值前待测血清培养后的细胞数计算细胞平均倍增时间；
[0023]d.克隆形成量：向6孔板每孔中加入待测血清培养基，每孔中加入50个细胞，第七天舍弃旧培养基，更换为新鲜待测血清培养基，第十四天舍弃更换后的培养基，加入PBS清洗细胞，多聚甲醛室温固定，再加入结晶紫染色液，室温染色后舍弃结晶紫染色液，再加入PBS 清洗细胞，清洗2
‑
3次，计算待测血清培养后的克隆形成量。
[0024]进一步的，步骤(2)中，标准血清的批号为11G271，待测血清的批号为11G292、11H240 和11H340。
[0025]进一步的，步骤a中，所述待测血清培养基的配方为：10％待测血清、质量浓度10％的4
‑
羟乙基哌嗪乙磺酸、10μg/L碱性成纤维细胞生长因子和DMEM基础培养基；所述 DMEM基础培养基为DMEM低糖基础培养基，是一种含各种氨基酸和葡萄糖的基础培养基，其中葡萄糖含量为1000mg/L。
[0026]进一步的，所述步骤b中，细胞悬液接种量为每孔接种1.5
×
105个间充质干细胞，培养箱的工作参数为：37℃，5％CO2条件下培养，新的6孔板中每孔接种量为1.5
×
105个间充质干细胞。
[0027]进一步的，所述步骤c中，调整细胞的终浓度为1.8
×
104/mL，步骤d中，多聚甲醛的质量浓度为4％。
[0028]与现有技术相比，本专利技术所达到的有益效果是：本专利技术建立了一种高效的胎牛血清评价标准，通过对大量数据的统计分析，建立了数学模型，对基于细胞学研究技术，复杂且不稳定的血清评价方法进行了模型化地归纳，可稳定、准确地对不同批次胎牛血清的适用性进行评价，快速准确筛选出适用于多种来源间充质干细胞培养的胎牛血清；确定了采用细胞增殖、细胞倍增时间以及克隆形成量等参数来综合评价干细胞专用血清的细胞学筛选实验路线，系统地提供了筛选间充质干细胞培养的胎牛血清的流程，较好地解决了科研
机构或企业花费大量时间从若干多个批号的胎牛血清产品中进行筛选适用胎牛血清的问题，为基于细胞学技术开展的各种为胎牛血清适用性评价的实验提供了有效参考，该方法简单高效，实用性强，适合应用推广。
附图说明
[0029]附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实施例一起用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制。在附图中：
[0030]图1是本专利技术根据细胞倍增时间绘制的生长曲线示意图。图2是本专利技术实施例中采用标准血清培养间充质干细胞后于100倍的显微成像图一；图3是本专利技术实施例中采用标准血清培养间充质干细胞后于100倍的显微成像图二。
具体实施方式
[0031]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种干细胞专用胎牛血清的筛选工艺，其特征在于：筛选工艺包括以下步骤：(1)取待测血清，检测待测血清的细胞平均扩增密度、细胞平均倍增时间、克隆形成量；(2)将步骤(1)得到的待测血清的细胞平均扩增密度、细胞平均倍增时间、克隆形成量，代入适用性指数计算模型计算得到适用性指数，具体计算模型为：其中：yks_Index:适用性指数；Ds：待测血清培养后的细胞平均倍增时间；Dc：标准血清培养后的细胞平均倍增时间；Ps：待测血清培养后的细胞平均扩增密度；Pc：标准血清培养后的细胞平均扩增密度；Cs：待测血清培养后的克隆形成量；Cc：标准血清培养后的克隆形成量；(3)根据步骤(2)中计算出的适用性指数进行待测血清评价，并根据评价结果进行筛选。2.根据权利要求1所述的一种干细胞专用胎牛血清的筛选工艺，其特征在于：步骤(1)包括以下步骤：a.细胞悬液制备：Ⅰ.取间充质干细胞复苏，接种至T25细胞培养瓶中，传代扩增，当间充质干细胞长到汇合度达80
‑
90％时，用胰酶消化，加入新鲜完全DMEM培养基吹打，转移至离心管中，离心去上清，离心去上清时的工作参数为：1200rpm下离心5min，加入新鲜DMEM基础培养基制备成细胞悬液；Ⅱ.取待测血清，加入DMEM基础培养基中配置待测血清培养基；b.细胞增殖：向6孔板每孔中加入待测血清培养基，设置复孔，每孔取细胞悬液接种，晃匀置于培养箱中培养48h，用胰酶将细胞消化并计数，然后接种间充质干细胞至新的6孔板中，重复以上操作，共培养三到五代，计算待测血清培养后的细胞平均扩增密度；c.细胞倍增时间：取细胞悬液加入待测血清培养基，调整细胞终浓度，向24孔板的12个孔中加入终浓度细胞悬液，设置复孔，分别在第1到7天消化细胞并计数，每天3个复孔，每隔24h用胰酶消化...

【专利技术属性】
技术研发人员：商春华，陈文峻，王玉洁，陈旭，陈刚，
申请(专利权)人：依科赛生物科技太仓有限公司，
类型：发明
国别省市：