一种刺参体液样品外泌体分离的方法技术

本发明专利技术涉及一种刺参体液样品外泌体分离方法。针对刺参的体液样品，初步过滤后混合等渗抗凝剂进行预处理，随后利用低温中速离心、高速离心、超速离心结合多次过滤的方法，提取分离刺参中的外泌体，并利用等渗缓冲液进行重悬，用于后续实验。本发明专利技术提出的刺参外泌体分离方法稳定有效，操作简单，所提取的外泌体完整性较强、含量较多、纯度较高。纯度较高。纯度较高。

【技术实现步骤摘要】
一种刺参体液样品外泌体分离的方法


[0001]本专利技术涉及外泌体提取分离的
，具体为一种刺参体液样品外泌体分离的方法。

技术介绍

[0002]外泌体(Exosomes,Exos)是来源于细胞质膜内陷的含有脂质双分子层膜结构的多泡小体，是细胞外囊泡(Extracellular vesicles,EVs)的一种。2013年诺贝尔生理学或医学奖颁发给研究“细胞的囊泡运输调控机制”的三位科学家，外泌体逐渐成为国际性的研究热点。外泌体中富含各种mRNA、miRNA和蛋白等，并可在不同的细胞之间转运，被靶细胞摄取后影响靶细胞的生物学行为，是重要的细胞间转运系统。外泌体特殊的膜结构能够保护其内部的RNA免受酶的降解，因此相对于体液RNA，外泌体中各类RNA更为稳定，含量更高。因此，外泌体是研究机体内各类核酸调控机制的重要研究对象。
[0003]刺参体液主要包括体腔液及波里氏囊体液，分别存于刺参的体腔及波里氏囊体中。由于刺参缺乏特异性免疫，体液是刺参进行机体防御重要的承担者。刺参体液中包含大量的吞噬细胞、桑葚细胞等体腔细胞，且含有凝集素、穿孔素和类补体样因子等体液免疫因子，二者共同组成刺参的天然免疫防御。在刺参响应高温、低氧、低盐、酸化、病原侵害等胁迫条件时，体腔液中的细胞及免疫因子发生变化且发挥重要功能，可削弱胁迫对机体的损害作用。
[0004]刺参体液中存在丰富的体腔细胞，可以分泌大量外泌体，是刺参免疫等生理生化及分子调控研究领域重要的研究对象。外泌体的完整性对于其生物活性至关重要。然而目前市场上已有的快速提取外泌体的试剂盒大多针对哺乳类动物，并不适用于刺参等棘皮动物，且普通的离心法未考虑刺参体液渗透压特性及体液中残留的肠道及呼吸树等组织样品碎片的影响，无法保证提取样品的完整性、产量、特异性及稳定性。因此针对刺参体液样品建立一套稳定有效、操作简单且能保障膜完整性的外泌体制备方法具有重要价值。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种刺参体液样品外泌体提取分离的方法，以解决刺参外泌体暂无明确提取方法的问题。
[0006]本专利技术涉及一种刺参体液样品外泌体分离方法。针对刺参的体液样品，初步过滤后混合等渗抗凝剂进行预处理，随后利用低温中速离心、高速离心、超速离心结合多次过滤的方法，提取分离刺参中的外泌体，并利用等渗缓冲液进行重悬，用于后续实验。
[0007]一种刺参体液样品外泌体分离的方法，主要包括以下步骤：
[0008](1)体液样品提取：
[0009]解剖刺参后收集体液样品500μL～50mL，筛绢过滤后置于离心管中；
[0010](2)体液样品处理：
[0011]向离心管中加入等体积量的刺参等渗抗凝剂混合；通过40μm网状过滤器过滤至离
心管中，进行后续提取；
[0012](3)低温中速离心：
[0013]低温中速离心15min后，将上清转移至新的离心管中，去除滤液中的碎片；
[0014](4)低温高速离心过滤：
[0015]将(3)中取得的上清液低温高速离心45min，得到的上清液使用无菌0.22μm过滤器进行过滤处理，去除样品中杂质及直径大于220nm以上的大颗粒囊泡；
[0016](5)低温超高速离心：
[0017]将(4)中取得的上清液转移至无菌超高速离心管中，低温超高速离心70min；小心吸弃上清液，保留超离管底的沉淀，即为刺参外泌体沉淀；
[0018](6)外泌体样品获取与保存：
[0019]用50～150μL预冷至4℃的等渗缓冲液重悬沉淀，转移至无菌EP管中，进行后续实验。刺参外泌体的长期保存条件为
‑
80℃。
[0020]刺参等渗抗凝剂(pH＝7.0～8.5(优选范围7.3～8.0))，于水溶液中各组分浓度分别为0.015～0.03M EGTA、0.30M～0.60M NaCl、0.005～0.05M KCl、0.01～0.2M Tri
‑
HCl；
[0021]刺参等渗缓冲液(pH＝7.0～8.5)，于水溶液中各组分浓度分别为0.0005～0.002M EGTA、0.20～0.53M NaCl、0.005～0.10M Tri
‑
HCl。
[0022]加入刺参等渗抗凝剂和等渗缓冲液的目的在于针对刺参的渗透压在提取过程中保持等渗，保证刺参细胞及外泌体完整性及稳定性。
[0023]多次过滤及离心的目的在于去除刺参解剖过程中产生的组织碎片、细胞碎片、杂质及大颗粒囊泡。
[0024]进一步的，步骤(1)中解剖刺参后，将其置于一次性培养皿中。使用一次性无菌注射器收集体液样品。过滤用的300目筛绢应灭菌，离心管应无菌无酶。
[0025]步骤(3)中中速离心的速度为3000
×
g,，步骤(4)中高速离心的速度为10000
×
g，步骤(5)中超高速离心的速度为120000
×
g。以上离心过程均需在低温4℃下进行。
[0026]步骤(2)及步骤(6)中的刺参等渗抗凝剂和等渗缓冲液中不含外泌体。
[0027]步骤(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)中所使用的离心管需提前进行灭菌处理。
[0028]本专利技术提出的刺参外泌体分离方法稳定有效，操作简单，所提取的外泌体完整性较强、含量较多、纯度较高。
附图说明
[0029]图1是实施例1、实施例2分离的刺参外泌体透射电镜检测结果(A.体腔液(100000
×
)；B.波里氏囊体液(60000
×
))。
[0030]图2是实施例1、实施例2分离的刺参外泌体标志蛋白检测结果。
[0031]图3是实施例5(A)、实施例6(B)、实施例7(C)、实施例8(D)、实施例9(E)分离的刺参外泌体电镜检测结果。
具体实施方式
[0032]以下对本专利技术的具体实施方式中，对于提取的外泌体所采用的电镜检测、粒径检测和Western blot检测方法统一如下：
[0033]电镜检测：
[0034]室温条件下，将10μL Gluta固定液(Solarbio,P1126)与10μL外泌体混合固定后滴加至铜网上，静置吸附5min后，用滤纸小心吸去多余的液体。室温下向铜网上滴加10μL饱和醋酸双氧铀溶液(国药集团,SPI
‑
02624)染色处理1min，用滤纸小心吸去多余的染色液。室温下在铜网上滴加25μL ddH2O后静置5min，再次滴加25μL ddH2O静置5min后，将铜网在室温下晾干。利用透射电子显微镜(JEOL,JEM
‑
1230)观察，电压设置为80kV。
[0035]粒径检测：
[0036]利用NanoSight纳米粒径分析仪(Malvern,NS300)检测，具体步骤如下：
[0037](1)打开仪器电源、电脑软件，确认左下方状态框本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种刺参体液样品外泌体分离的方法，其特征在于，主要包括以下步骤：(1)取刺参体液与刺参等渗抗凝剂混合，刺参体液与刺参等渗抗凝剂的体积比为1.5:1～1:1.5(优选1:1～1:1.2)；通过孔径20～60(优选35～45)μm筛网过滤，收集滤液；刺参等渗抗凝剂(pH＝7.0～8.5(优选范围7.3～8.0))，于水溶液中各组分浓度分别为0.015～0.03M EGTA、0.30M～0.60M NaCl、0.005～0.05M KCl、0.01～0.2M Tri
‑
HCl；(2)2～6℃下以300～6000
×
g(优选1000～4000
×
g)的速度离心，去除滤液中的碎片，收集上清液；(3)将步骤(2)中取得的上清液，2～6℃下以8000～20000
×
g(优选10000～16500
×
g)的速度离心，得到的上清液使用孔径0.18～0.30(优选0.21～0.24)μm筛网进行过滤处理，去除样品中杂质及大颗粒囊泡，得到上清液；(4)将步骤(3)中取得的上清液，2～6℃下以90000～200000
×
g(优选100000～150000
×
g)的速度离心；弃上清液，得到的沉淀即为刺参外泌体。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，用预冷至2～6℃的等渗缓冲液重悬沉淀，用于刺参外泌体的保存，等渗缓冲液的使用...

【专利技术属性】
技术研发人员：霍达，孙丽娜，林承刚，杨红生，张立斌，刘石林，崔玮，苏芳，
申请(专利权)人：中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：