一种混合限制酶及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种混合的限制性内切酶，所述混合限制性内切酶包括限制酶DpnI和SgeI组成，其中限制酶中DpnI和SgeI浓度分别为1～1.5U/μL，1～2.5U/μL。本发明专利技术还公开了一种混合限制性内切酶在消化甲基化DNA和定点突变中的应用，与单独使用DpnI相比，该混合酶消化甲基化DNA的效果显著提升，残留率降低90％以上，反应时间缩短了75％左右。在定点突变应用中，仅需酶切反应15min即可实现99％以上的阳性率。率。

【技术实现步骤摘要】
一种混合限制酶及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种混合限制酶及其应用。

技术介绍

[0002]基因定点突变通常指改变基因上某个特定的碱基对，从而迅速、高效地改变基因所表达蛋白的性质，是生物医学领域中一种非常有用的手段。目前常用的一种体外定点突变技术是利用甲基化特异的限制性内切酶DpnI。首先将待突变的基因克隆到质粒上，将质粒转化到基因型为Dam+(腺嘌呤甲基化)的大肠杆菌感受态细胞中扩繁，然后提取质粒作为模板，用带有突变位点的引物进行PCR扩增，获得带有突变位点的质粒。因为受体菌体内存在Dam甲基化机制，所以从感受态细胞中提取的野生型质粒DNA带有甲基化修饰；而以野生型质粒为模板，在体外通过PCR扩增获得的突变体质粒，则没有被甲基化修饰。这时，加入特异性识别并切割甲基化位点的限制性内切酶DpnI，野生型质粒模板会被消化为片段，而突变体质粒不受影响。此后再将DpnI消化产物环化后转化入大肠杆菌中，筛选阳性克隆，放大培养，即可提取到纯粹的突变体质粒。
[0003]目前使用上述技术的定点突变试剂盒中用于消化模板的限制酶全部为DpnI。DpnI识别序列为腺嘌呤N6位被甲基化的GATC，并切割甲基化的位点。当识别序列中两条DNA链上的两个腺嘌呤N6位都被甲基化时，DpnI呈现正常的活性；当只有一个腺嘌呤N6位被甲基化时，DpnI酶切活力会降低约60倍以上。但由于质粒在大肠杆菌中经常出现甲基化不完全的情况，即DNA双链中只有1条链上的腺嘌呤被甲基化，导致DpnI往往对野生型模板消化不完全，使消化后的转化产物含有较多假阳性克隆菌落，增加筛选的实验成本。
[0004]目前部分厂商推出的快速DpnI产品，宣称“最适反应温度下在15min内能够完全消化1μg质粒DNA”。但这里的“完全消化”一般是通过酶切产物琼脂糖电泳判断。由于琼脂糖电泳的分辨率有限，无法鉴定低于0.1ng的DNA残留。此种程度的DNA残留对限制酶的普通应用没有显著影响；但如果在定点突变中，0.1ng以下的残留模板质粒转化后仍然会产生相当数量(100以上)的阳性克隆，会显著增加假阳性率。因此，为了保证模板消化效果，市售的定点突变试剂盒推荐的模板消化时间大多在1
‑
2小时以上。如果为了缩短反应时间而增加单酶用量，则可能产生星号活性，即非特异性切割，可能导致突变体质粒也被切割，影响点突变效率。
[0005]SgeI是另一种甲基化特异的限制性内切酶，特异性识别并切割单链或双链DNA上含有5
‑
甲基胞嘧啶(即大肠杆菌Dcm甲基化)的DNA靶标。该酶发现较晚，单独使用需要专门的反应缓冲液，目前无快速酶产品，消化所需时间1h以上，目前应用较少，尚未被应用到定点突变中。

技术实现思路

[0006]专利技术目的：针对现有技术中存在的问题，本专利技术提供一种反应时间更短、模板消化效率更高的混合限制酶，命名为Template Eliminator。
[0007]本专利技术还提供所述混合限制酶的应用。
[0008]技术方案：为了实现上述目的：本专利技术提供一种混合限制酶，其特征在于，所述混合限制酶包括限制酶DpnI和SgeI。
[0009]进一步地，所述混合限制酶中DpnI和SgeI浓度分别为1～1.5U/μL，1～2.5U/μL。
[0010]本专利技术还提供一种混合限制酶在消化甲基化DNA和定点突变中的应用。
[0011]进一步地，所述消化甲基化DNA的反应体系包括质粒DNA、混合限制酶、10
×
CutOne Buffer和无核酸酶水。
[0012]作为优选，所述消化甲基化DNA反应体系包括1μg质粒DNA、1μL混合型限制酶、2μL 10
×
CutOne Buffer、无核酸酶水补充到20μL。
[0013]进一步地，所述混合限制性内切酶在消化甲基化DNA中的应用具体过程为：(1)将质粒转化到基因型为Dam+/Dcm+的大肠杆菌感受态细胞中培养扩繁获得甲基化修饰的质粒DNA；(2)提取被Dam和Dcm甲基化修饰的质粒DNA；(3)取1μg质粒DNA，1μL混合限制酶，再加入2μL 10
×
CutOne Buffer，最后加入无核酸酶水补充到20μL后反应；(4)将反应产物重新转化到大肠杆菌中，观察菌落数。
[0014]作为优选，上述使用常规的遗传转化方法，将质粒转化到基因型为Dam+/Dcm+的大肠杆菌感受态细胞中培养扩繁，所用的感受态细胞是Mach1
‑
T1，亦可使用DH5α等其他Dam+/Dcm+基因型的感受态细胞；使用常规分子生物学方法提取质粒，获得的质粒DNA是已经被Dam和Dcm甲基化修饰的。
[0015]进一步地，所述混合限制酶在定点突变应用中的具体过程为：(1)将待突变基因克隆到质粒载体上；(2)将质粒转入基因型为Dam+/Dcm+的大肠杆菌感受态细胞中培养扩繁；(3)提取质粒；(4)设计含有突变后位点的引物，以提取的质粒为模板进行PCR扩增；(5)取扩增产物40
–
50μL，加入1μL混合限制酶反应；(6)将产物转化入大肠杆菌中培养，筛选阳性克隆。
[0016]作为优选，上述使用常规分子克隆方法，将待突变基因克隆到质粒载体上。使用常规遗传转化方法，将质粒转入基因型为Dam+/Dcm+的大肠杆菌感受态细胞中培养扩繁，所用的感受态细胞是Mach1
‑
T1，亦可使用DH5α等其他Dam+/Dcm+基因型的感受态细胞。使用常规分子生物学方法提取质粒；使用带有所需突变位点的引物，以提取的质粒为模板进行PCR扩增。扩增可使用三步法，亦可使用两步法，循环数一般不超过30个，建议使用高保真DNA聚合酶，尽量保证扩增产物不发生其他突变。取扩增产物40
‑
50μL，直接加入1μL Template Eliminator，37℃反应15min。
[0017]其中，混合限制酶在消化甲基化DNA和定点突变中的反应条件为37℃下反应15
‑
60min。
[0018]作为优选，混合限制酶在消化甲基化DNA和定点突变中的反应条件为37℃下反应15min。
[0019]本专利技术提供的一种混合限制酶试剂盒。
[0020]其中，所述一种混合限制酶试剂盒在快速酶反应中的应用。
[0021]进一步地，所述快速酶反应包括消化甲基化DNA和定点突变。
[0022]有益效果：与现有技术相比，本专利技术具有如下优点：
[0023](1)本专利技术所述混合限制酶与使用单酶相比，消化甲基化DNA效果显著提升，相比
DpnI单酶，模板残留率降低90％以上；相比SgeI单酶，模板残留率降低98％以上；
[0024](2)本专利技术大幅提高了酶反应效率，在消化甲基化DNA的应用中，混合限制酶仅需15min即可完全消化甲基化的DNA模板，相对使用单酶时间缩短了75％左右。
[0025](3)本专利技术所述本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种混合限制酶，其特征在于，所述混合限制酶包括限制酶DpnI和SgeI。2.根据权利要求1所述的混合限制酶，其特征在于，所述混合限制酶中限制酶DpnI和SgeI浓度分别为1～1.5U/μL，1～2.5U/μL。3.一种如权利要求1或者2所述的混合限制酶在消化甲基化DNA和定点突变中的应用。4.根据权利要求3所述混合限制酶在消化甲基化DNA中的应用，其特征在于，所述消化甲基化DNA的反应体系包括甲基化质粒DNA、混合限制酶、10
×
CutOne Buffer和无核酸酶水。5.根据权利要求4所述混合限制酶在消化甲基化DNA中的应用，其特征在于，所述应用的具体过程为：(1)将质粒转化到大肠杆菌感受态细胞中培养扩繁获得甲基化修饰的质粒DNA；(2)提取甲基化修饰的质粒DNA；(3)将甲基化修饰的质粒D...

【专利技术属性】
技术研发人员：高尊昉，邓锐，程槐旭，张旭宁，刘杨，
申请(专利权)人：江苏百时美生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：