BRCA全外显子基因突变检测用组合物、试剂盒、测序文库构建方法技术

本发明专利技术涉及分子诊断技术领域，具体涉及BRCA全外显子基因突变检测用组合物、试剂盒、测序文库构建方法。本发明专利技术组合物中特异性扩增引物对靶向区域包括全部编码区；外显子和内含子交界处

【技术实现步骤摘要】
BRCA全外显子基因突变检测用组合物、试剂盒、测序文库构建方法


[0001]本专利技术涉及分子诊断
，具体涉及BRCA全外显子基因突变检测用组合物、试剂盒、测序文库构建方法。

技术介绍

[0002]BRCA1/2是两种抑癌基因，分别位于人类17号、13号染色体上，可通过编码产生肿瘤抑制蛋白，在基因转录、DNA损伤修复及细胞增殖等方面发挥重要的作用。当这两个基因发生突变后，其蛋白产物不能正常行使功能，就会导致同源重组修复机制的缺陷，从而使细胞可能发生其他遗传信息的改变，导致癌症的发生。乳腺癌和卵巢癌是女性患者中最常见的癌症，患者的死亡率极高。在西方国家，女性乳腺癌或者卵巢癌患者的人数仅次于肺癌。患癌的风险既包括外在的环境和行为因素，也包括内在的遗传因素。研究表明，遗传性乳腺癌占乳腺癌总体的5～10％，该类患者约90％发生BRCA1基因或BRCA2基因突变，而BRCA1基因突变或BRCA2基因突变的携带者患乳腺癌的危险为60％～85％，患卵巢癌的风险分别为39％～44％和11～18％。另有研究证明，40％～50％的遗传性乳腺癌是由BRCA1基因突变引起的。因此，开发针对性强、灵敏度高和兼备普适性的BRCA1/2检测试剂盒，实现乳腺癌/卵巢癌早期诊断筛查、预后监测以及个体化用药指导，是预防乳腺癌/卵巢癌发生或提高患者生存率和生存质量的关键，其建设迫在眉睫、意义重大。
[0003]BRCA1和BRCA2基因变异多种多样，涉及到近万个变异位点，而且这些突变分散遍布于各个外显子，没有证明表明存在突变热点区域，高通量二代测序技术以其更为高效快速且能一次性对BRCA1和BRCA2基因所有外显子及邻近上下游区域内的变异同时进行检测，成为了目前BRCA1/2基因突变检测的常用方法。目前市面上利用二代测序技术进行BRCA1和BRCA2基因所有外显子检测的产品大多是基于多重扩增法构建覆盖BRCA1/2全外显子序列的文库用于下一步NGS测序，该类产品的关键在于多重扩增特异性引物的设计，需要结合样本中提取的DNA的特性，不同引物之间扩增效率的差异等设计合适的多重扩增引物序列结构和组合。FFPE样本制备中受高温和福尔马林的影响，基因组DNA存在不同程度的片段化。已有产品由于其原始设计问题，应用于FFPE样本的突变检测存在覆盖率、均一性等问题导致检测结果灵敏度和准确性低。

技术实现思路

[0004]为了克服现有技术的缺陷，本专利技术的目的之一在于提供BRCA全外显子基因突变检测用组合物，以靶向BRCA1和BRCA2基因所有外显子编码区、及外显子和内含子交界处
±
20bp为目标设计特异性扩增引物对，产生的扩增子长度范围为120bp
‑
200bp，能够靶向捕获小片段DNA模板，应用在FFPE样本提取的DNA模板，提高模板利用率。
[0005]本专利技术的目的之二在于提供BRCA全外显子基因突变检测用试剂盒，包括本专利技术组合物。
[0006]本专利技术的目的之三在于提供BRCA全外显子基因突变检测用测序文库构建方法，包括采用本专利技术组合物进行多重PCR特异性扩增，测序文库的测序结果显示均一性(0.2x)达到99％，捕获效率达到97％。
[0007]为了实现以上目的，本专利技术采用的技术方案如下：
[0008]BRCA全外显子基因突变检测用组合物，包括特异性扩增引物，所述特异性扩增引物包括216对特异性扩增引物对，其中每对特异性扩增引物对的正向引物和反向引物5
’
至3
’
端依次包括通用序列和特异性序列；每对特异性扩增引物对正向引物的特异性序列如SEQ ID NO.n(n为1～216的任一整数)，对应的反向引物的特异性序列如SEQ ID NO.n+216(n为1～216的任一整数)。
[0009]进一步的，各特异性扩增引物对的用量比例如下表1所示：
[0010]表1
[0011][0012][0013][0014][0015][0016][0017]作为优选的，每对特异性扩增引物对正向引物和反向引物的通用序列为与基因测序平台适配的接头序列。在本专利技术的具体实施例中，通用序列为与illumina二代测序平台适配的接头序列。具体的，每对特异性扩增引物对正向引物的通用序列如SEQ ID NO.433；对应的反向引物的通用序列为SEQ ID NO.434。
[0018]为了实现对特异性扩增引物对扩增的产物的进一步扩增放大，上述组合物还包括正向通用扩增引物和反向通用扩增引物；所述正向通用扩增引物的3
’
端包括与特异性扩增引物正向引物的通用序列互补的序列；反向通用扩增引物的3
’
端包括与特异性扩增引物反向引物的通用序列互补的序列。
[0019]作为优选的，在本专利技术的具体实施例中所述正向通用扩增引物的序列为SEQ ID NO.435：
[0020]AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACNNNNNNNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT；
[0021]反向通用扩增引物的序列为SEQ ID NO.436：
[0022]CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNGTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGA；其中NNNNNNNN为8bp的index序列。
[0023]BRCA全外显子基因突变检测用试剂盒，包括上述组合物。进一步的，还包括含有DNA聚合酶、dNTP溶液的PCR扩增试剂。
[0024]BRCA全外显子基因突变检测测序文库构建方法，包括以下操作步骤：
[0025]1)特异性扩增：以提取的人基因组DNA为模板，以上述组合物中的216对特异性扩增引物对为引物进行多重PCR扩增，得到特异性扩增产物；
[0026]2)通用扩增：将步骤1)制备的特异性扩增产物纯化后，以上述组合物中的正向通用扩增引物和反向通用扩增引物为引物进行扩增，纯化后制得所述文库。
[0027]步骤1)特异性扩增的具体过程包括将216对特异性扩增引物对分为两组分别进行多重PCR扩增，然后将每组特异性扩增产物混合；其中SEQ ID NO.n(n为1～108的任一整数)和SEQ ID NO.n+216(n为1～108的任一整数)为第一组；SEQ ID NO.n(n为109～216的任一整数)和SEQ ID NO.n+216(n为109～216的任一整数)为第二组。
[0028]作为优选的，上述人基因组DNA为FFPE组织中提取的人基因组DNA。
[0029]本专利技术有益效果：
[0030]1)本专利技术BRCA全外显子基因突变检测用组合物中的特异性扩增引物对靶向区域包括全部编码区；外显子和内含子交界处
±
20bp；5UTR区：2号外显子全长+1号内含子至少20bp；3UTR区：终止密码子之后至少20bp；所有转录本的编码区的并集；
[0031]2)本专利技术特异性扩增引物对以人基本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.BRCA全外显子基因突变检测用组合物，包括特异性扩增引物，其特征在于，所述特异性扩增引物包括216对特异性扩增引物对，其中每对特异性扩增引物对的正向引物和反向引物5
’
至3
’
端依次包括通用序列和特异性序列；每对特异性扩增引物对正向引物的特异性序列如SEQ ID NO.n(n为1～216的任一整数)，对应的反向引物的特异性序列如SEQ ID NO.n+216(n为1～216的任一整数)。2.如权利要求1所述的BRCA全外显子基因突变检测用组合物，其特征在于，每对特异性扩增引物对的用量比例如下表所示：
3.如权利要求1或2所述的BRCA全外显子基因突变检测用组合物，其特征在于，每对特异性扩增引物对正向引物和反向引物的通用序列为与基因测序平台适配的接头序列。4.如权利要求3所述的BRCA全外显子基因突变检测用组合物，其特征在于，每对特异性扩增引物对正向引物的通用序列如SEQ ID NO.433；对应的反向引物的通用序列为SEQ ID NO.434。5.如权利要求1或2或4任一项所述的BRCA全外显子基因突变检测用组合物，其特征在于，还包括正向通用扩增引物和反向通用扩增引物；所述正向通用扩增引物的3
’
端包括与特异性扩增引物正向引物的通用序列互补的序列；反向通用扩增引物的3
’
端包括与特异性扩增引物反向引物的通用序列互补的序列。6.如权利要求5所述的BRCA全外显子基因突变检测用组合物，其特征在于，所述正向通用扩增引物的序列为SEQ ID NO.435：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACN...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨山井，张莉娟，张银，张晓亮，张瑞峰，
申请(专利权)人：郑州安图生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：