肠癌筛查试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及用于受试者肠癌筛查的多突变联合检测试剂盒。具体涉及肠癌筛查试剂盒，其包括用于检测18个基因位点的突变水平的PCR检测剂。本发明专利技术的检测对象可以是粪便，方便取样，从成本、操作难度和身心上减少了患者及医院的负担，且该试剂盒对肠癌及肠进展期腺瘤的检测灵敏度高，可辅助临床对肠癌进行早期筛查。可辅助临床对肠癌进行早期筛查。

【技术实现步骤摘要】
肠癌筛查试剂盒


[0001]本专利技术属于生物
，涉及一种肠癌筛查试剂盒，具体涉及利用该试剂盒检测相关基因突变的方法及其在肠癌筛查中的用途。

技术介绍

[0002]结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是全球男性发病率中排名第三，女性发病率中排名第二的消化道恶性肿瘤。有资料显示早期大肠癌(I期、II期)术后5年存活率高达90％、80％，而晚期大肠癌(III期、IV期)术后5年存活率只30％和10％。结直肠从上皮增生到癌变的过程需要经历相对漫长的时间，这就给结直肠癌的筛查和治疗提供了机会，越早筛查越可以有效降低该疾病的发病率和死亡率。目前，临床上大肠癌筛查有两种方式，一种是非侵入性方法，即粪便隐血试验，另一种是侵入性方法，即结直肠镜检。其中，粪便隐血实验简单易行，但是由于灵敏度和特异性较差，肠道穿孔风险高的缺陷，且易受多种因素的影响，误诊漏诊可能性大。结直肠镜检虽然是目前临床检测的金标准，但其易受到操作者经验和肿瘤部位的影响，而且患者依从性差。
[0003]近年来，一些新型分子筛查手段也在临床上逐渐推广开来。博尔诚公司推出的血浆Septin9甲基化基因检测，该方法无创、方便，但它对I期CRC敏感性只有45％，对癌前肠进展期腺瘤检测的敏感性极低(5％～15％)，说明该标记物识别癌前病变的能力差。EXACT science的产品conlonguard在肠进展期腺瘤的检出率可达42.4％，而特异性不足90％，这必然会造成一定程度上的过渡诊疗；另外conlonguard通过甲基化+突变+FIT三种分子标志物联合检测的方法进行肠癌早筛，需要通过拟合算法的方式进行结果判读，操作繁琐且无法实现临床的快速检测；最后值得一提的是，突变在其中只是发挥辅助作用，目前尚未有人基于PCR平台单独采用突变检测的方式实现肠癌的早筛。

技术实现思路

[0004]本专利技术通过对肠癌粪便样本进行突变检测，筛选出高频的基因突变位点可用于肠癌早期的筛查，提供相应的位点突变组合及实现上述目的的肠癌筛查试剂盒的引物探针及其组成方式。有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供一种可辅助肠癌筛查及诊断的多突变联合的基因突变组合方式；本专利技术的目的之二在于提供一种上述多突变联合检测的肠癌筛查试剂盒；本专利技术的目的之三在于提供上述肠癌筛查试剂盒在确定受试者是否患有肠进展期腺瘤或结直肠癌或处于患有肠进展期腺瘤或结直肠癌的风险中的用途；
[0005]为实现上述专利技术目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0006]1.试剂盒，其特征在于包括用于检测以下18个基因位点的PCR检测剂：KRAS G12V、KRAS G13D、KRAS G12D、KRAS R1450*、BRAF V600E1、PIK3CA H1047R、KRAS G12C、APC E1309Dfs*、PIK3CAE545K、KRAS G12S、RNF4 Gly659fs、APC R1114*、APC R876*、KRAS G12R、KRAS K117N(351A＞T)、APC Q1378*、TP53 R273C和CTNNB1 T41A，优选地所述试剂盒用于诊断患有肠进展期腺瘤或结直肠癌或诊断处于患有肠进展期腺瘤或结直肠癌的风险中。
[0007]2.根据项2所述的试剂盒，其特征在于所述PCR检测剂包括针对所述18个基因突变的引物，优选地，所述引物为：
[0008]针对KRAS G12V的分别如SEQ ID NO：4和56所示的上游引物和下游引物；
[0009]针对KRAS G13D的分别如SEQ ID NO：1和53所示的上游引物和下游引物；
[0010]针对KRAS G12D的分别如SEQ ID NO：2和54所示的上游引物和下游引物；
[0011]针对APC R1450*的分别如SEQ ID NO：31和83所示的上游引物和下游引物；
[0012]针对BRAF V600E1的分别如SEQ ID NO：16和68所示的上游引物和下游引物；
[0013]针对PIK3CA H1047R的分别如SEQ ID NO：34和86所示的上游引物和下游引物；
[0014]针对KRAS G12C的分别如SEQ ID NO：7和59所示的上游引物和下游引物；
[0015]针对APC E1309Dfs*的分别如SEQ ID NO：29和81所示的上游引物和下游引物；
[0016]针对PIK3CA E545K的分别如SEQ ID NO：35和87所示的上游引物和下游引物；
[0017]针对KRAS G12S的分别如SEQ ID NO：5和57所示的上游引物和下游引物；
[0018]针对RNF43 Gly659fs的分别如SEQ ID NO：52和104所示的上游引物和下游引物；
[0019]针对APC R1114*的分别如SEQ ID NO：28和80所示的上游引物和下游引物；
[0020]针对APC R876*的分别如SEQ ID NO：27和79所示的上游引物和下游引物；
[0021]针对KRAS G12R的分别如SEQ ID NO：6和58所示的上游引物和下游引物；
[0022]针对KRAS K117N(351A＞T)的分别如SEQ ID NO：8和60所示的上游引物和下游引物；
[0023]针对APC Q1378*的分别如SEQ ID NO：30和82所示的上游引物和下游引物；
[0024]针对TP53 R273C的分别如SEQ ID NO：38和90所示的上游引物和下游引物；
[0025]针对CTNNB1 T41A的分别如SEQ ID NO：45和97所示的上游引物和下游引物。
[0026]3.根据项2所述的试剂盒，其特征在于所述PCR检测剂还包括双链特异性荧光染料、dNTP、DNA聚合酶、探针、blocker、外控引物、内参引物中的一种或多种，优选地所述探针的浓度为500nM。
[0027]4.根据项3所述的试剂盒，其中所述探针为：
[0028]针对KRAS G12V的如SEQ ID NO：108所示的探针；
[0029]针对KRAS G13D的如SEQ ID NO：105所示的探针；
[0030]针对KRAS G12D的如SEQ ID NO：106所示的探针；
[0031]针对APC R1450*的如SEQ ID NO：135所示的探针；
[0032]针对BRAF V600E1的如SEQ[D NO：120所示的探针；
[0033]针对PIK3CA H1047R的如SEQ ID NO：138所示的探针；
[0034]针对KRAS G12C的如SEQ ID NO：111所示的探针；
[0035]针对APC E1309Dfs*的如SEQ ID NO：133所示的探针；
[0036]针对PIK3CA E545K的如SEQ ID NO：139所示的探针；
[0037]针对KRAS G本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.试剂盒，其特征在于包括用于检测以下18个基因位点的PCR检测剂：KRAS G12V、KRAS G13D、KRAS G12D、KRAS R1450*、BRAF V600E1、PIK3CA H1047R、KRAS G12C、APC E1309Dfs*、PIK3CA E545K、KRAS G12S、RNF4 Gly659fs、APC R1114*、APC R876*、KRAS G12R、KRAS K117N(351A＞T)、APC Q1378*、TP53 R273C和CTNNB1 T41A，优选地所述试剂盒用于诊断患有肠进展期腺瘤或结直肠癌或诊断处于患有肠进展期腺瘤或结直肠癌的风险中。2.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述PCR检测剂包括针对所述18个基因突变的引物，优选地，所述引物为：针对KRAS G12V的分别如SEQ ID NO：4和56所示的上游引物和下游引物；针对KRAS G13D的分别如SEQ ID NO：1和53所示的上游引物和下游引物；针对KRAS G12D的分别如SEQ ID NO：2和54所示的上游引物和下游引物；针对APC R1450*的分别如SEQ ID NO：31和83所示的上游引物和下游引物；针对BRAF V600E1的分别如SEQ ID NO：16和68所示的上游引物和下游引物；针对PIK3CA H1047R的分别如SEQ ID NO：34和86所示的上游引物和下游引物；针对KRAS G12C的分别如SEQ ID NO：7和59所示的上游引物和下游引物；针对APC E1309Dfs*的分别如SEQ ID NO：29和81所示的上游引物和下游引物；针对PIK3CA E545K的分别如SEQ ID NO：35和87所示的上游引物和下游引物；针对KRAS G12S的分别如SEQ ID NO：5和57所示的上游引物和下游引物；针对RNF43 Gly659fs的分别如SEQ ID NO：52和104所示的上游引物和下游引物；针对APC R1114*的分别如SEQ ID NO：28和80所示的上游引物和下游引物；针对APC R876*的分别如SEQ ID NO：27和79所示的上游引物和下游引物；针对KRAS G12R的分别如SEQ ID NO：6和58所示的上游引物和下游引物；针对KRAS K117N(351A＞T)的分别如SEQ ID NO：8和60所示的上游引物和下游引物；针对APC Q1378*的分别如SEQ ID NO：30和82所示的上游引物和下游引物；针对TP53 R273C的分别如SEQ ID NO：38和90所示的上游引物和下游引物；针对CTNNB1 T41A的分别如SEQ ID NO：45和97所示的上游引物和下游引物。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述PCR检测剂还包括双链特异性荧光染料、dNTP、DNA聚合酶、探针、blocker、外控引物、内参引物中的一种或多种，优选地所述探针的浓度为500nM。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其中所述探针为：针对KRAS G12V的如SEQ ID NO：108所示的探针；针对KRAS G13D的如SEQ ID NO：105所示的探针；针对KRAS G12D的如SEQ ID NO：106所示的探针；针对APC R1450*的如SEQ ID NO：135所示的探针；针对BRAF V600E1的如SEQ ID NO：120所示的探针；针对PIK3CA H1047R的如SEQ ID NO：138所示的探针；针对KRAS G12C的如SEQ ID NO：111所示的探针；针对APC E1309Dfs*的如SEQ ID NO：133所示的探针；针对PIK3CA E545K的如SEQ ID NO：139所示的探针；针对KRAS G12S的如SEQ ID NO：109所示的探针；
针对RNF43 Gly659fs的如SEQ ID NO：156所示的探针；针对APC R1114*的如SEQ ID NO：132所示的探针；针对APC R876*的如SEQ ID NO：131所示的探针；针对KRAS G12R的如SEQ ID NO：110所示的探针；针对KRAS K117N(351A＞T)的如SEQ ID NO：112所示的探针；针对APC Q1378*的如SEQ ID NO：134所示的探针；针对TP53 R273C的如SEQ ID NO：142所示的探针；针对CTNNB1 T41A的如SEQ ID NO：149所示的探针。5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于，所述探针带有可检测的标记。6.根据权利要求1
‑
5中任一项所述的试剂盒，其特征在于所述PCR检测剂中的一种或更多种分装于1～18个中任意一个数目的独立包装，优选8个或8个以上独立包装，更优选地8个独立包装。7.根据权利要求1
‑
5中任一项所述的试剂盒，其还包括说明书，所述说...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙爱娟，徐荣荣，乔岩，田甜，孙玉龙，王弢，
申请(专利权)人：苏州普瑞迈德医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：