一种豌豆蛋白源DPP-IV抑制肽及其筛选方法技术

本发明专利技术公开了一种豌豆蛋白源DPP

【技术实现步骤摘要】
一种豌豆蛋白源DPP
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IV抑制肽及其筛选方法


[0001]本专利技术涉及一种豌豆蛋白源DPP
‑
IV抑制肽及其筛选方法，属于食源性活性肽开发


技术介绍

[0002]根据国际糖尿病联盟(IDF)的数据，2021年全球成年糖尿病患病率约为5.37亿，预计到2045年将达到7.84亿。其中，2型糖尿病(T2D)约占已确诊糖尿病的90％。T2D以高血糖为特征，可导致心血管疾病(中风、心肌梗死、高血压、心力衰竭等)、神经退行性疾病、肾病等一系列并发症。针对以上问题，许多抗糖尿病药物已被开发并用于T2D的治疗，其中DPP
‑
IV抑制剂是最有前景的降糖药物之一。DPP
‑
IV抑制剂通过抑制胰高血糖素样肽
‑
1(GLP
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1)和葡萄糖依赖性胰岛素多肽(GIP)等激素的失活而产生降糖作用。GLP
‑
1和GIP可有效刺激胰岛素的分泌，然而其易被DPP
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IV降解而迅速失活，从而失去其调节血糖的功能。因此，抑制DPP
‑
IV的活性有利于T2D的治疗。目前已有几种合成DPP
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IV抑制剂(如:西格列丁、维格列丁等)获批并用于临床应用。然而，这些合成的DPP
‑
IV抑制剂可能会导致一些不良反应，如胃肠道问题、尿路感染和严重的皮肤反应。此外，其高昂的价格也使得低收入人群难以承担。
[0003]作为一种天然、安全的补充剂，食源性DPP
‑
IV抑制肽具有调节葡萄糖稳态的功能。目前，已从多种食品蛋白质中获得了大量高活性的DPP
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IV抑制肽，表现出较好的降血糖效果。
[0004]但，传统的DPP
‑
IV抑制肽鉴定方法是通过逐级分离纯化，如：超滤、色谱柱分离等手段获得纯度较高的肽段，再通过质谱对其结构进行鉴定，最后通过体外合成并进一步验证其DPP
‑
IV抑制活性。这种方法操作复杂、耗时且费用高。因此，开发一种更加方便、高效、快速的DPP
‑
IV抑制肽的鉴定方法以成为当务之急。
[0005]豌豆蛋白是一种低敏、营养且经济的蛋白质资源，通过酶解豌豆蛋白产生活性肽，具有良好的抗氧化、降血糖等生物活性。迄今为止，尚未发现关于豌豆蛋白源DPP
‑
IV抑制肽的报道。

技术实现思路

[0006][技术问题][0007]本专利技术要解决的技术问题是现有食品源DPP
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IV抑制肽的分离鉴定方法复杂、成本高，且无豌豆蛋白源的DPP
‑
IV抑制肽。
[0008][技术方案][0009]本专利技术提供一种从豌豆蛋白中筛选DPP
‑
IV抑制肽的方法，是利用多肽组学与分子对接技术快速筛选DPP
‑
IV抑制肽，主要包括以下步骤：
[0010](1)利用蛋白酶水解豌豆蛋白产生豌豆肽
[0011]将豌豆蛋白粉与水混合，加热使豌豆蛋白受热变性，然后添加蛋白酶对豌豆蛋白
进行水解，水解结束后，将豌豆蛋白水解液加热灭酶，然后冷却、离心，取上清冻干；
[0012](2)将步骤(1)所得冻干物经Sephadex G
‑
15进行分离，选择具有相对高的抑制DPP
‑
IV能力的部分进行下一步的测序；
[0013](3)通过多肽组学对步骤(2)分离得到的部分豌豆肽进行测序；
[0014](4)利用分子对接技术从步骤(3)测序得到的豌豆肽中筛选高活性的DPP
‑
IV抑制肽。
[0015]在本专利技术的实施方式中，所述豌豆蛋白粉是指去除豌豆中的淀粉与脂肪后的干燥的蛋白粉末。
[0016]在本专利技术的实施方式中，所述蛋白酶是复合蛋白酶，可以切割豌豆蛋白的多个位点。
[0017]在本专利技术的某些实施方式中，步骤(1)可采用如下实施条件：将豌豆蛋白粉与蒸馏水按1:20(w/v)的比例混合，预热10分钟中途持续搅拌，以确保豌豆蛋白完全受热变性；待豌豆蛋白溶液冷却至室温后，添加Protamex(酶底比：5 000U/g蛋白)于pH 7.0、55℃条件下水解3h。在水解过程中，使用1mol/L的NaOH或HCl来维持溶液的pH值恒定；水解后，将豌豆蛋白水解液煮沸10分钟，终止水解反应；待冷却至4℃，于8 000g离心20min，取上清冻干后于
‑
20℃保存，以备下一步分离纯化。
[0018]在本专利技术的某些实施方式中，步骤(2)通过Sephadex G
‑
15对豌豆肽进行初步分离，选择分离纯化后的高活性的组分F2进行下一步的测序，以提高筛选结果的准确度同时减少筛选过程的工作量。具体可采用如下实施条件：将60mg冻干后的豌豆蛋白水解液的上清冻干物分散于3mL去离子水中，过0.45μM滤膜，用Sephadex G
‑
15柱分离；以流速30mL/h的超纯水洗脱，每管收集3mL洗脱馏分，选择DPP
‑
IV抑制活性高的馏分用于进一步的测序分析。
[0019]在本专利技术的某些实施方式中，步骤(4)可具体采用如下步骤：
[0020]①
DPP
‑
IV酶PDB文件准备：从蛋白质数据库中检索DPP
‑
IV酶的蛋白质晶体结构(代码：1WCY)，从1WCY中去除多余的配体diprotin A与H2O以便进行后续的对接实验；
[0021]②
测序后的多肽依次与1WCY对接后获得Vina Score，DPP
‑
IV结合位点被定义为包含15个以内的蛋白质残基的球体；
[0022]③
根据Vina Score筛选结合能较低的多肽，并将已公开序列的DPP IV抑制肽排除，剩余的多肽确定为潜能DPP IV抑制肽，通过体外固相合成并验证其DPP IV抑制活性。所述结合能的值越低表示相应多肽的DPP
‑
IV抑制活性越强。所述体外固相合成具体是多肽化学合成方法(Fmoc固相合成法)。所述验证DPP IV抑制活性具体是筛选后的多肽经合成后，使用底物化学法测定其DPP IV抑制活性的强弱以验证筛选结果。
[0023]本专利技术提供豌豆源DPP
‑
IV抑制肽，其氨基酸序列是IPYWTY、IPYWT、LPNYN或LAFPGSS，优选IPYWTY，所述IPYWTY能够以极低的浓度抑制DPP
‑
IV活性，其IC
50
为11.04μM，低于大多数目前已被鉴定的DPP
‑
IV抑制肽，甚至与阳性对照diprotin A的抑制活性(IC
50
＝3.2μM)接近。
[0024][有益效果][0025]本专利技术通过分子对接的虚拟筛选方法快速有效地从豌豆蛋白中鉴定得到高活性DPP...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种从豌豆蛋白中筛选DPP
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IV抑制肽的方法，其特征在于，主要包括以下步骤：(1)利用蛋白酶水解豌豆蛋白产生豌豆肽；(2)将步骤(1)所得豌豆肽用色谱进行分离，选择具有相对高的抑制DPP
‑
IV能力的部分进行下一步的测序；(3)通过多肽组学对步骤(2)分离得到的部分豌豆肽进行测序；(4)利用分子对接技术从步骤(3)测序得到的豌豆肽中筛选高活性的DPP
‑
IV抑制肽。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，主要包括以下步骤：(1)利用蛋白酶水解豌豆蛋白产生豌豆肽将豌豆蛋白粉与水混合，加热使豌豆蛋白受热变性，然后添加蛋白酶对豌豆蛋白进行水解，水解结束后，将豌豆蛋白水解液加热灭酶，然后冷却、离心，取上清冻干；(2)将步骤(1)所得冻干物经Sephadex G
‑
15进行分离，选择具有相对高的抑制DPP
‑
IV能力的部分进行下一步的测序；(3)通过多肽组学对步骤(2)分离得到的部分豌豆肽进行测序；(4)利用分子对接技术从步骤(3)测序得到的豌豆肽中筛选高活性的DPP
‑
IV抑制肽。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述豌豆蛋白粉是指去除豌豆中的淀粉与脂肪后的干燥的蛋白粉末。4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶是复合蛋白酶，能够切割豌豆蛋白的多个位点。5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)采用如下实施条件：将豌豆蛋白粉与蒸馏水按1:20的比例混合，预热以确保豌豆蛋白完全受热变性；待豌豆蛋白溶液冷却至室温后，添加复合蛋白酶于pH 7.0、55℃条件下水解；在水解过程中，维持溶液的pH值恒定；水解后，将豌豆蛋白水解液煮沸灭酶；待冷却至4...

【专利技术属性】
技术研发人员：张晖，张明凯，朱玲，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：