用于制备HBVcccDNA的核酸、载体和宿主细胞制造技术

本发明专利技术涉及一种用于制备HBV cccDNA的核酸、载体和宿主细胞。该用于制备HBV cccDNA的核酸包括第一节段和与所述第一节段连接的第二节段，第一节段和第二节段各自独立转录，第一节段包括编码核心蛋白的Core基因、编码HBV聚合酶的Pol基因和编码HBx的X基因，第二节段包括与前基因组RNA对应的核酸片段和与起始密码子对应的核酸片段，与起始密码子对应的核酸片段位于与前基因组RNA对应的核酸片段的转录方向的3

【技术实现步骤摘要】
用于制备HBV cccDNA的核酸、载体和宿主细胞


[0001]本专利技术涉及基因工程
，特别是涉及一种用于制备HBV cccDNA的核酸、载体和宿主细胞。

技术介绍

[0002]慢性乙型肝炎是由于感染乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)引起的疾病。HBV是一种DNA病毒，属于嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)。在乙肝病毒的复制过程中，病毒DNA进入宿主细胞核，在DNA聚合酶的作用下，两条链的缺口均被补齐，形成超螺旋的共价、闭合、环状DNA分子(covalently closed circular DNA，cccDNA)。cccDNA是乙肝病毒前基因组RNA复制的原始模板，在病人肝脏组织内，即使在病毒复制最为活跃的阶段，每个肝细胞内也只有不超过50个拷贝。作为产生新病毒的模板，HBV cccDNA虽然其含量较少，但对乙肝病毒的复制、感染状态建立、临床治疗过程中的病毒再激活等病毒具有十分重要的意义。只有完全清除了细胞核内的HBV cccDNA，才能达到彻底治愈HBV感染和携带状态，才能获得乙肝患者完全治愈，是抗病毒治疗的终极目标。
[0003]现阶段的临床治疗通常采用核苷类似物(nucleot(s)ide analogs，NAs)和干扰素(interferon，IFN)两种方案：核苷类似物能有效抑制病毒的复制和反转录过程，阻止新病毒产生。但因为核苷类似物在药物设计上并非直接以cccDNA作为治疗靶点，因而不能直接减少HBV cccDNA，即使经过数年的抗病毒治疗，HBV抗原的血清学转换率也不超过20％。临床使用中也遇到耐药株出现并传播的问题，这主要是因为HBV新病毒产生过程中的反转录环节RNA与DNA非严格配对导致了高突变率，最终导致抵抗核苷类似物类药物的耐药株病毒流行；干扰素是一类主要免疫调节类药物，在HBV治疗领域内的应用依据还是基于干扰素具有广泛抗病毒活性，但是干扰素作用的机理不清楚，临床适应范围比较有限，不适用于所有HBV感染者，在特殊人群有较好治愈率，但详细作用机制仍在研究中，也是HBV治疗领域的热点。
[0004]目前对于cccDNA的大多数认识是基于DHBV感染鸭模型，但是人的cccDNA和鸭的cccDNA生物学特征差异较大，以DHBV为模型所得知识对研究人HBV cccDNA的实际指导意义非常有限。而近年来对cccDNA研究的细胞系模型，主要分为两大类：一类通过携带HBV基因的假病毒感染细胞株，转录表达形成cccDNA，另外一类则通过一系列分子生物学的手段在胞内诱导形成cccDNA。然而，采用这两种细胞系形成cccDNA的效率较低，并不能很好模拟出体内cccDNA产生过程的真实状态。

技术实现思路

[0005]基于此，有必要提供一种用于制备HBV cccDNA的核酸，该核酸能够提高HBV cccDNA在细胞内的形成效率。
[0006]此外，还有必要提供一种能够提高HBV cccDNA形成效率的载体及宿主细胞。
[0007]一种用于制备HBV cccDNA的核酸，包括第一节段和与所述第一节段连接的第二节
段，所述第一节段和所述第二节段各自独立转录，所述第一节段包括编码核心蛋白的Core基因、编码HBV聚合酶的Pol基因和编码HBx的X基因，所述第二节段包括与前基因组RNA对应的核酸片段和与起始密码子对应的核酸片段，所述与起始密码子对应的核酸片段位于所述与前基因组RNA对应的核酸片段的转录方向的3
’
端，在所述第二节段中，所述与起始密码子对应的核酸片段仅有一个，所述核酸不含编码HBs蛋白的S基因的表达框。
[0008]在上述用于制备HBV cccDNA的核酸中，第一节段用于表达HBV核心蛋白、HBV聚合酶和HBx。第一节段表达的HBx可以提高HBV cccDNA的转录活性，可以使HBV cccDNA所携带的基因表达水平大大提高；第一节段表达的HBV核心蛋白和HBV聚合酶可以保证第二节段产生的HBV前基因组RNA(pre
‑
genomic RNA,pgRNA)反转录成为HBV cccDNA，而且在形成环形HBV cccDNA之后，第二节段3
’
端的起始密码子所对应的核酸片段位于与前基因组RNA对应的核酸片段的5
’
端，形成的HBV cccDNA可以转录出5
’
端带有AUG的转录本，此时的病毒RNA序列可以翻译成完整蛋白。
[0009]此外，在HBV病毒复制周期中，HBc首先形成空核衣壳(Capsid)，在空核衣壳中，HBV pgRNA通过HBV Pol逆转录产生rcDNA，形成成熟的核衣壳。此后的成熟核衣壳有两个归宿。归宿一：细胞外分泌途径，是成熟核衣壳的主要归宿，成熟核衣壳与内质网上的HBsAg形成带有包膜的完整病毒颗粒，并通过出芽方式释放出去；归宿二：内循环途径，是次要归宿，占比较小，成熟核衣壳通过目前还不完全清除的途径，形成细胞核内的cccDNA。在缺少了HBsAg的情况下，细胞外分泌途径被阻断，所有成熟核衣壳被改为内循环途径，可以极大增加细胞核内HBV cccDNA水平。因此，通过将上述用于制备HBV cccDNA的核酸设计为不含编码HBs的S基因的表达框，在第一节段和第二节段中均失活了HBV表面蛋白(HBs)的编码框，避免了生产cccDNA的过程中产生HBsAg，提高了cccDNA的生成水平。
[0010]另外，上述用于制备HBV cccDNA的核酸制备HBV cccDNA时，cccDNA的生成不依赖于HBV病毒感染，同时也避免感染性病毒产生，可以使得研究工作可以在常规P2实验室进行开展，延申其应用场景。
[0011]在其中一个实施例中，所述第二节段还包括报告基因，所述报告基因、所述与前基因组RNA对应的核酸片段及所述起始密码子对应的核酸片段在所述第二节段的转录方向上依次连接。
[0012]在其中一个实施例中，所述报告基因选自荧光素酶基因、氯霉素乙酰转移酶基因、β
‑
半乳糖苷酶基因、分泌性人胎盘碱性磷酸酶基因和绿色荧光蛋白基因中的至少一种。
[0013]在其中一个实施例中，所述Core基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
[0014]及/或，所述Pol基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
[0015]及/或，所述X基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
[0016]在其中一个实施例中，所述第一节段还包抗生素抗性基因，所述抗生素抗性基因与所述Core基因由编码2A肽的核酸片段连接；可选地，所述抗生素抗性基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0017]在其中一个实施例中，所述第一节段的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
[0018]及/或，所述第二节段的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
[0019]一种用于制备HBV cccDNA的载体，包括上述的用于制备HBV cccDNA的核酸。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于制备HBV cccDNA的核酸，其特征在于，包括第一节段和与所述第一节段连接的第二节段，所述第一节段和所述第二节段各自独立转录，所述第一节段包括编码核心蛋白的Core基因、编码HBV聚合酶的Pol基因和编码HBx的X基因，所述第二节段包括与前基因组RNA对应的核酸片段和与起始密码子对应的核酸片段，所述与起始密码子对应的核酸片段位于所述与前基因组RNA对应的核酸片段的转录方向的3
’
端，在所述第二节段中，所述与起始密码子对应的核酸片段仅有一个，所述核酸不含编码HBs蛋白的S基因的表达框。2.根据权利要求1所述的核酸，其特征在于，所述第二节段还包括报告基因，所述报告基因、所述与前基因组RNA对应的核酸片段及所述起始密码子对应的核酸片段在所述第二节段的转录方向上依次连接。3.根据权利要求2所述的核酸，其特征在于，所述报告基因选自荧光素酶基因、氯霉素乙酰转移酶基因、β
‑
半乳糖苷酶基因、分泌性人胎盘碱性磷酸酶基因和绿色荧光蛋白基因中的至少一种。4.根据权利要求3所述的核酸，其特征在于，所述Core基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；及/或，所述Pol...

【专利技术属性】
技术研发人员：李锋，冯成千，
申请(专利权)人：广州市第八人民医院，
类型：发明
国别省市：