靶向HBVcccDNA的药物筛选模型及方法技术

本发明专利技术涉及病毒学领域，特别是乙肝病毒治疗领域。具体地，本发明专利技术涉及用于筛选HBV cccDNA抑制剂的模型及方法。本发明专利技术的筛选模型及方法以拆分荧光素酶的检测作为HBV cccDNA检测的替代指标，能够高通量地筛选靶向cccDNA的药物。的药物。的药物。

【技术实现步骤摘要】
靶向HBV cccDNA的药物筛选模型及方法


[0001]本专利技术涉及病毒学领域，特别是乙肝病毒治疗领域。具体地，本专利技术涉及用于筛选HBV cccDNA抑制剂的模型及方法。

技术介绍

[0002]乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)导致的慢性乙型肝炎(简称慢乙肝，chronic hepatitis B,CHB)是全球范围最严重的公共卫生问题之一，全球每年有超过80万人死于包括慢性活动性肝炎(chronic active hepatitis)、乙肝相关肝硬化(liver cirrhosis)及原发性肝癌(hepatocellular carcinoma)等在内的各类由乙肝病毒感染引起的肝脏疾病。目前临床上主要的两类治疗药物(核苷类似物和干扰素)都很难实现临床治愈。HBV cccDNA的稳定存在是慢乙肝难以治愈的关键原因之一，目前临床上的药物都不能有效清除cccDNA,胞内存在的cccDNA可以持续作为病毒复制和转录的模板。
[0003]由于HBV cccDNA形成和维持的机制复杂，直接设计针对cccDNA的药物高度困难，一种可以用于高通量筛选cccDNA抑制剂的筛选模型为开发清除cccDNA的药物提供了新的方法。cccDNA的检测方法复杂，Southern blot是cccDNA检测的金标准，但是细胞用量大，操作复杂，耗时长，不能用于高通量的药物筛选；荧光定量PCR检测相对Southern blot简单快速，通量较高，但也难以应用于大规模的药物筛选，而且检测可能受rcDNA干扰。利用其他更易检测的标志物作为cccDNA检测的替代指标可以降低检测成本，提高检测效率，提高检测的通量。
[0004]理想的cccDNA报告模型应该既满足cccDNA的来源稳定，又满足作为替代检测指标的标记易检测，信噪比高。因此，发展适合用于高通量筛选的HBV cccDNA报告模型是十分必要的。

技术实现思路

[0005]本申请的专利技术人经过大量实验和反复摸索，构建了以拆分荧光素酶作为HBV cccDNA检测替代指标的HBV cccDNA报告模型，其操作简单、耗时短，可实现高通量的药物筛选。因此可利用这种模型进行初筛，获得对HBV cccDNA有抑制潜力的候选药物，再通过更多的HBV体内外研究模型进行验证。
[0006]报告模型I
[0007]在一些情况下，可以将荧光素酶片段互补技术(LFCA)中的第一片段序列(例如HiBiT)整合入HBV基因组以形成HBV变体，以该HBV变体为模板转录的mRNA缺乏该第一片段(例如HiBiT)表达的起始密码子，不能翻译偶联该第一片段(例如HiBiT)标签的蛋白，只有以该HBV变体转录的pgRNA逆转录形成cccDNA后，以cccDNA为模板转录的mRNA才能翻译偶联该第一片段(例如HiBiT)标签的蛋白，因此可以通过荧光素酶片段互补技术(LFCA)测定该第一片段(例如HiBiT)的表达水平，从而指示HBV cccDNA的形成情况。
[0008]1、分离的核酸分子
[0009]因此，在第一方面，本专利技术提供了一种分离的核酸分子，其包含HBV基因组序列(例如野生型HBV基因组)的变体，所述变体包括：包含C
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ORF、S
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ORF和P
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ORF的HBV基因组片段，并且所述C
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ORF在precore和core基因之间包含外源插入序列，所述外源插入序列包含编码荧光素酶第一片段的核苷酸序列。所述荧光素酶第一片段能够与荧光素酶片段互补技术(LFCA)中的相应的荧光素酶第二片段结合，并产生荧光素酶活性。
[0010]在本文中，术语“荧光素酶片段互补技术(LFCA)”具有本领域技术人员通常理解的含义，其将荧光素酶分为各自无酶活性的第一片段和第二片段，当这两个片段在相互作用时可以相互补充，产生荧光素酶活性，从而在存在荧光素酶底物的情况下释放发光信号。在某些示例性实施方案中，所述荧光素酶片段互补技术基于来自Promega公司的LgBiT以及能够与其互补结合的小片段(例如HiBiT或SmBiT)，通过LgBiT与HiBiT或SmBiT的结构互补以产生功能性酶。
[0011]在某些实施方案中，所述荧光素酶第一片段是LgBiT，所述荧光素酶第二片段是能够与LgBiT互补结合的小片段(例如HiBiT或SmBiT)。
[0012]在某些实施方案中，所述荧光素酶第一片段是能够与LgBiT互补结合的小片段(例如HiBiT或SmBiT)，所述荧光素酶第二片段是LgBiT。在某些实施方案中，所述荧光素酶第一片段是HiBiT，所述荧光素酶第二片段是LgBiT。在某些实施方案中，HiBiT具有如SEQ ID NO:2所示的序列。在某些实施方案中，所述编码HiBiT的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0013]在某些实施方案中，所述HBV基因组片段还包含X
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ORF。
[0014]在某些实施方案中，所述变体在HBV基因组序列(例如野生型HBV基因组)的precore和core基因之间包含所述外源插入序列。
[0015]在某些实施方案中，所述外源插入序列包含多个拷贝的以串联重复方式存在的编码荧光素酶第一片段(例如HiBiT)的核苷酸序列。在某些实施方案中，所述外源插入序列包含三个拷贝的以串联重复方式存在的编码荧光素酶第一片段(例如HiBiT)的核苷酸序列。
[0016]在某些实施方案中，所述多个拷贝的以串联重复方式存在的编码荧光素酶第一片段(例如HiBiT)的核苷酸序列中的每个拷贝在其5
’
端均包含编码连接肽的序列。在某些实施方案中，所述连接肽是柔性肽接头。在某些实施方案中，所述连接肽由G(甘氨酸)和/或S(丝氨酸)组成。在某些实施方案中，所述连接肽是GSG。
[0017]在某些实施方案中，所述外源插入序列包含如SEQ ID NO:4所示的序列。
[0018]在某些实施方案中，所述HBV基因组是全长基因组，例如，HBV基因型A、B、C、D、E、F、G或H的基因组。在某些实施方案中，所述HBV基因组是超长度基因组，例如1.1倍体基因组或1.3倍体基因组。在某些实施方案中，所述HBV基因组是1.1倍体基因组，例如如SEQ ID NO:1所示。
[0019]在某些实施方案中，所述外源插入序列与诱导型启动子可操作地连接。
[0020]在某些实施方案中，所述外源插入序列通过Tet
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On基因调控表达系统而被调控表达。因此，在某些实施方案中，所述诱导型启动子是Tet
‑
On基因调控表达系统中的操纵基因(Tet operator,TetO)或启动子，其必须要Doxycycline结合与之相应的反式激活蛋白才能启动转录。
[0021]在某些实施方案中，所述诱导型启动子是TRE3G启动子(例如，如SEQ ID NO:5所示)，与之相应的反式激活蛋白是Tet
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.分离的核酸分子，其包含HBV基因组序列的变体，所述变体包括：包含C
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ORF、S
‑
ORF和P
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ORF的HBV基因组片段，并且所述C
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ORF在precore和core基因之间包含外源插入序列，所述外源插入序列包含编码荧光素酶第一片段的核苷酸序列；所述荧光素酶第一片段能够与荧光素酶片段互补技术(LFCA)中相应的荧光素酶第二片段结合，并产生荧光素酶活性。2.权利要求1所述的分离的核酸分子，其中，所述HBV基因组片段还包含X
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ORF。3.权利要求1或2所述的分离的核酸分子，其中，所述变体在HBV基因组序列的precore和core基因之间包含所述外源插入序列。4.权利要求1
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3任一项所述的分离的核酸分子，其中，所述荧光素酶第一片段是能够与LgBiT互补结合的小片段，例如HiBiT或SmBiT；所述荧光素酶第二片段是LgBiT；优选地，所述荧光素酶第一片段是HiBiT，所述荧光素酶第二片段是LgBiT。5.权利要求4所述的分离的核酸分子，其中，所述外源插入序列包含多个拷贝的以串联重复方式存在的编码所述荧光素酶第一片段(例如HiBiT)的核苷酸序列；优选地，所述外源插入序列包含三个拷贝的以串联重复方式存在的编码所述荧光素酶第一片段(例如HiBiT)的核苷酸序列。6.权利要求5所述的分离的核酸分子，其中，所述多个拷贝的以串联重复方式存在的编码所述荧光素酶第一片段(例如HiBiT)的核苷酸序列中的每个拷贝在其5
’
端均包含编码连接肽(例如柔性肽接头)的序列。7.权利要求1所述的分离的核酸分子，其中，所述外源插入序列包含如SEQ ID NO:4所示的序列。8.权利要求1
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7任一项所述的分离的核酸分子，其中，所述HBV基因组是全长基因组，或者是超长度基因组，例如1.1倍体基因组或1.3倍体基因组；优选地，所述HBV基因组包含如SEQ ID NO:1所示的序列。9.权利要求1
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8任一项所述的分离的核酸分子，其进一步包含与所述外源插入序列可操作地连接的诱导型启动子；优选地，所述诱导型启动子是TRE3G启动子，或者包含Tet操纵因子序列(TetO)的一个或多个重复；优选地，所述诱导型启动子具有双向启动活性，例如具有双向启动活性的TRE3G启动子。10.权利要求9所述的分离的核酸分子，其中，所述分离的核酸分子进一步包含与所述诱导型启动子可操作地连接的报告基因；优选地，所述报告基因与所述外源插入序列的方向相反；优选地，所述报告基因选自荧光蛋白基因(例如iRFP)和/或抗生素抗性基因(例如Blasticidin)；优选地，所述报告基因包含荧光蛋白基因和抗生素抗性基因；优选地，所述荧光蛋白基因和抗生素抗性基因任选地通过编码自裂解肽(例如P2A，E2A，F2A或T2A)的核苷酸序列连接。11.权利要求9或10所述的分离的核酸分子，其中，所述分离的核酸分子包含如SEQ ID NO:8所示的序列。12.重组HBV cccDNA，其包含权利要求1
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11任一项所述的分离的核酸分子；
优选地，所述重组HBV cccDNA包含权利要求1
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11任一项中所述的HBV基因组序列的变体；优选地，所述重组HBV cccDNA由权利要求1
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11任一项所述的分离的核酸分子环化形成。13.表达系统，其包含权利要求9
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11任一项所述的分离的核酸分子作为第一核酸序列，并且包含第二核酸序列，所述第二核酸序列包含编码与所述第一核酸序列中所包含的诱导型启动子相对应的反式激活蛋白的核苷酸序列；优选地，所述反式激活蛋白选自Tet
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On 3G反式激活蛋白、rTetR、rtTA；优选地，所述第二核酸序列还包含与所述编码反式激活蛋白的核苷酸序列可操作地连接的表达调控元件，例如启动子(例如组成型启动子)和/或增强子。14.权利要求13所述的表达系统，其中，所述第一核酸序列包含TRE3G启动子作为诱导型启动子，所述第二核酸序列包含编码Tet
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On 3G反式激活蛋白的核苷酸序列；优选地，所述TRE3G启动子包含如SEQ ID NO:5所示的序列；优选地，所述编码Tet
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On 3G反式激活蛋白的核苷酸序列包含如SEQ ID NO:10所示的序列。15.载体，其包含权利要求1
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11任一项所述的分离的核酸分子，或者包含权利要求13或14所述的表达系统。16.权利要求15所述的载体，其中，所述载体包含权利要求13或14所述的表达系统，其中所述第一核酸序列和第二核酸序列被提供在相同或不同的载体上；优选地，所述第一核酸序列和第二核酸序列被提供在相同的载体上。17.权利要求15或16所述的载体，其中，所述载体是转座子载体，例如PiggyBac转座子载体；优选地，所述第一核酸序列和第二核酸序列位于所述转座子载体的两个ITR序列之间。18.共转染系统，其包含权利要求15
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17任一项所述的载体，以及转座酶表达载体；优选地，所述转座酶表达载体是PiggyBac转座酶表达载体。19.宿主细胞，其包含权利要求1
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11任一项所述的分离的核酸分子，或权利要求12所述的重组cccDNA，或权利要求13或14所述的表达系统，或权利要求15
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17任一项所述的载体，或权利要求18所述的共转染系统；优选地，所述宿主细胞选自肝细胞来源的真核细胞，例如肝瘤细胞或肝细胞；优选地，所述宿主细胞选自HepaRG、HepG2或Huh7。20.权利要求19所述的宿主细胞，其中，所述宿主细胞在其基因组中包含权利要求13或14所述的表达系统；优选地，当存在与所述诱导型启动子及反式激活蛋白相对应的诱导物(例如Doxycycline)时，所述宿主细胞能够稳定表达由所述HBV基因组序列的变体所形成的HBV cccDNA。21.试剂盒，其包含权利要求1
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11任一项所述的分离的核酸分子，或权利要求13或14所述的表达系统，或权利要求15
‑
17任一项所述的载体，或权利要求18所述的共转染系统，或权利要求19或20所述的宿主细胞；优选地，所述试剂盒包含：权利要求15
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17任一项所述的载体，或权利要求18所述的共
转染系统；优选地，所述试剂盒包含：权利要求19或20所述的宿主细胞；优选地，所述试剂盒还包含LgBiT蛋白以及任选的荧光素酶底物；优选地，所述试剂盒还包含与所述诱导型启动子及反式激活蛋白相对应的诱导物(例如Doxycycline)。22.用于筛选HBV cccDNA抑制剂的方法，其包括：(1)提供权利要求20所述的宿主细胞；(2)将诱导试剂与所述宿主细胞接触，所述诱导试剂是与所述宿主细胞中所包含的诱导型启动子及反式激活蛋白相对应的诱导物(例如Doxycycline)；(3)将受试试剂与所述宿主细胞接触；其中，步骤(2)和(3)可以同时进行或者以任意顺序进行；(4)检测所述宿主细胞的细胞上清中的所述荧光素酶第一片段水平。23.权利要求22所述的方法，其中，步骤(1)包括以下步骤：(1a)将权利要求13或14所述的表达系统中的第一核苷酸序列和第二核苷酸序列引入宿主细胞中，其中所述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列被提供在相同或不同的表达载体上，并且，所述第一核酸序列是权利要求9
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11任一项所述的分离的核酸分子；(1b)培养所述宿主细胞；优选地，所述宿主细胞选自肝细胞来源的真核细胞，例如肝瘤细胞或肝细胞；优选地，所述宿主细胞选自HepaRG、HepG2或Huh7；优选地，在步骤(1a)中，所述表达载体是转座子载体(例如PiggyBac转座子载体)，该步骤进一步包括：将转座酶表达载体(例如PiggyBac转座酶表达载体)引入所述宿主细胞；优选地，所述步骤(1)还包括：(1c)鉴定并选择在其基因组中已整合权利要求13或14所述的表达系统的宿主细胞；优选地，通过检测所述第一核酸序列所包含的报告基因来鉴定所述宿主细胞的基因组中是否已整合所述表达系统。24.权利要求22或23所述的方法，其中，在步骤(4)中，通过荧光素酶片段互补技术来检测荧光素酶第一片段水平；优选地，通过与所述荧光素酶第一片段互补的荧光素酶第二片段来检测；优选地，所述荧...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁权，曹佳莉，张雅丽，王明凤，马建，张天英，张军，夏宁邵，
申请(专利权)人：养生堂有限公司，
类型：发明
国别省市：