基于表面增强拉曼散射技术的脑钠肽检测装置及检测方法制造方法及图纸

本发明专利技术公开了一种基于表面增强拉曼散射技术的急性心肌梗死分泌的血清学标志物脑钠肽检测装置及方法。首先通过纳米压印、化学键修饰对应BNP的抗体分子，完成SERS衬底芯片制备；在BNP抗体溶液挥发过程中，形成以六聚体或多聚体为结构单元的坍塌手指阵列结构。本发明专利技术可同时实现BNP的高选择性和高灵敏性SERS检测，通过把血清滴入事先置入生物载波片的耦合结构衬底，直接对Au手指表面进行光学聚焦，可实现5秒内液体血清环境下特定BNP的高选择性和高灵敏度测量。和高灵敏度测量。和高灵敏度测量。

【技术实现步骤摘要】
基于表面增强拉曼散射技术的脑钠肽检测装置及检测方法


[0001]本专利技术属于分析检测
，具体涉及基于表面增强拉曼散射技术的急性心肌梗死分泌标志物脑钠肽检测装置及方法。

技术介绍

[0002]以急性心肌梗死(Acute Myocardial Infarction,AMI)为代表的心血管疾病发病率呈逐年升高趋势，AMI有起病急、病情演变快、随时有心律失常而导致心源性猝死，其致死率、致残率高，属于心血管危急症。目前AMI已超过肺癌成为死亡率最高的主要疾病。
[0003]目前国际上AMI临床生化检测的最快速度是肌红蛋白和肌钙蛋白的检测，常规需要20分钟。上海川至生物技术有限公司研制生产的“肌钙蛋白I快速检测卡”可实现15分钟目视观察检测结果。15～20分钟的检测时间相比生命流逝的极速而言，还是不够快。医院采用的急性心肌梗死检测方案仍存在一些缺陷。例如，几种免疫分析技术，包括荧光检测、化学发光、电化学检测等，已被用于同时定量患者血清中的肌红蛋白(Mb)，肌钙蛋白(TnT)，肌酸激酶同工酶(CK
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MB) 和脑钠肽前体(pro
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BNP)四项，其中脑钠肽前体(pro
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BNP)一般简称为脑钠肽(BNP)。由于急性心肌梗死患者的抢救时间非常关键，国家卫健委对心肌梗死标志物的检测时间希望能够降低。因此如何快速实现对AMI标志物分子的指纹识别对医学救治起到非常关键的作用。
[0004]脑钠肽(BrainNatriuretic PeptideBNP)又称B型利钠肽(B
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type NatriureticPeptide)、脑利钠肽，是继心钠肽(ANP)后利钠肽系统的又一成员，它首先是由日本学者Sudoh等于1988年从猪脑分离出来因而得名,主要来源于心室。BNP具有重要的病理生理学意义,可以促进排钠、排尿，具较强的舒张血管作用,可对抗肾素
‑ꢀ
血管紧张素
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醛固酮系统(RAAS)的缩血管作用，同ANP一样是人体抵御容量负荷过重及高血压的一个主要内分泌系统心功能障碍能够极大地激活利钠肽系统，心室负荷增加导致BNP释放。目前，虽然脑钠肽含量在AMI诊断中有很高的价值, 但脑钠肽水平的测定并没有得到很好的普及,主要原因是检测方法的制约。脑钠肽检测的方法学研究一直是脑钠肽研究的热点。检测脑钠肽的主要方法有免疫放射分析法(RIMA)，免疫荧光法等，RIMA法由于半衰期短、检测时间长不适合于AMI的急性诊断和小样本检测。Biosite公司推出的免疫荧光法测定脑钠肽水平, 达到了快速检测的目的,但需专门的荧光分析仪,成本很高,不适合发展中国家。 Bayer Diagnostics公司、Abbott公司也推出了脑钠肽测定试剂，但成本均较高。
[0005]拉曼散射效应由印度科学家C.V.Raman在1928年发现，主要基于入射光和物质的非弹性散射，使得入射光失去部分能量(取决于分子本身的结构)，从而识别分子的指纹信息。相比其他的检测方法(如荧光检测)，无需样品处理、水不敏感(医学生物检测尤其有用)及微区微量检测、几秒中内完成等特点，在疾病标志物分子的快速指纹检测有重要的应用前景。但根据量子力学选择定律，拉曼效应的散射截面只有荧光信号的百亿分之一，信号非常弱。随着微纳光学的发展，人们发现金属微纳结构的费米能级附近导带上的自由电子与入射光相互耦合，表面自由电子集体相干涨落会形成一种局域的电磁模式，将入射光场能
量汇聚在亚波长的空间范围内，在金属表面附近形成局域增强电磁场，利用此增强电磁场会显著的提高位于金属表面附近分子的拉曼散射的强度，实现表面增强拉曼 (Surface
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Enhanced Raman Scattering,SERS)检测。SERS技术的出现为AMI血清中BNP的快速检测、微量检测乃至单分子检测(早期预警及早期诊断的需要)提供了一种有效的途径。
[0006]在金属微纳结构表面等离激元光学效应的SERS应用中，如何调控局域光场的激发并获得较强的局域光场态密度，对于其增强SERS的效率至关重要。相比单个纳米结构的共振激发，金属耦合结构由于结构之间存在间隙等离激元耦合效应而会产生更强的局域光场，因而受到广泛关注。1999年武汉大学徐红星院士针对SERS单分子检测的实验现象(Phys.Rev.Lett.,1999,83(21):4357
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4360)，首次发现是由Ag纳米粒子之间超小间隙中的耦合电磁场引起的，场增强可达103倍以上，使SERS增强因子达到10
12
，从而解释了SERS的单分子检测现象。近年来，英国伯明翰大学张霜等利用卷曲纳米碗结合介质、金纳米粒子沉积得到金耦合结构，实现了宽频段的单分子SERS检测(Nat.Commun.,2018,9(1):5248
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5255)。
[0007]基于上述SERS增强物理机制，目前，SERS应用于AMI中标志物BNP分子的检测同时需要解决两方面的难题：第一，如何实现BNP的高敏感性和特异性检测：病人血清中除了存在BNP分子外，还存在几千种以上的其它生物蛋白等，如何在血清中只检测待测的标志物分子；第二，如何实现AMI标志物BNP的快速检测：这对于AMI的早期诊断、早期预警非常重要。高选择性检测要求金属结构可以捕获分子，高灵敏度检测要求被捕获的分子处于金属结构中增强电磁场区域，两者同时实现是基于SERS的心血管疾病标志物BNP分子检测应用的关键。
[0008]我们在前期结合EBL、光刻及纳米压印等技术实现了具有结构单元精确可调的柔性金属纳米手指阵列有序结构(ACS Nano,2017,11(6):5836
‑
5843；Small, 2018,14:1801146
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1801155；ZL201710825180.0；ZL201910666854.6)。这种金属纳米手指阵列可通过滴定溶剂，利用其挥发过程中的表面张力，会使靠的很近的柔性纳米手指之间相互坍塌靠在一起。通过这种技术，可以结合BNP抗体修饰技术事先连接到Au表面，通过坍塌，然后靠在一起形成Au纳米手指/BNP抗体/Au 纳米手指耦合结构，由于BNP抗体的空间纵向尺寸在亚纳米级，因此形成的耦合结构可实现量子等离激元调控下的增强电磁场；在这种耦合结构中，抗体分子作为耦合结构间隙层，既可以捕获心血管疾病标志物BNP分子，又可以局域标志物 BNP分子在间隙层中，由于耦合增强电磁场主要分布在间隙层中，因此可同时实现BNP分子的高选择性和高灵敏性SERS检测。具体应用中，通过把血清滴入事先置入生物载波片的纳米手指耦合结构衬底，可实现在液体血清环境下特定心血管疾病标志物分子的高选择性和高灵敏度测量，检测时间为5秒左右，远小于目前医院标准的BNP检测时间(10
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15分钟)。

技术实现思路

[0009]为解决现有技术的不足，提供一种AMI标志物分子BNP的高选择性和高灵敏性检测要求的表面增强拉曼基本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于表面增强拉曼散射技术的脑钠肽检测装置，其特征在于它是由以下步骤制备而得：1)采用纳米压印、Au薄膜沉积及反应离子束刻蚀制备Au纳米手指有序阵列结构；2)将对应BNP的抗体分子溶液滴加在步骤1制备的Au纳米手指有序阵列结构上进行孵育，时间为8小时，使得抗体分子与Au结合；3)将步骤2孵育好的Au纳米手指有序阵列结构拿出，室温及空气环境下自然干燥后，用超纯水冲洗去未连接且多余的BNP抗体分子，再用超纯水浸泡30分钟，取出在自然条件下干燥；4)在溶液挥发过程中，微表面张力使得相邻六个或更多个纳米手指相互靠在一起，形成以六聚体或多聚体为结构单元的坍塌Au手指阵列结构，手指结构之间形成2倍BNP抗体尺寸大小的亚纳米间隙，可产生量子等离激元调控的增强耦合电磁场，此外，抗体分子分布在Au纳米手指表面，可捕获BNP分子到耦合电磁场中。2.如权利要求1所述的检测装置，其特征在于：步骤1中Au纳米手...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘凡新，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：