一种芸香科植物的遗传转化体系、遗传转化方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种芸香科植物的遗传转化体系、遗传转化方法和应用，涉及遗传转化技术领域。本发明专利技术提供一种以发根农杆菌K599介导的，直接对芸香科植物的枝条进行遗传转化的遗传转化体系。利用本发明专利技术所述遗传转化体系可进行遗传转化和基因编辑，能够有效克服农杆菌转化法的诸多缺陷；遗传转化体系周期为14～28天，节省时间，有效缩短柑橘基因功能研究周期；遗传稳定性高，可以避免嵌合体的形成。利用本发明专利技术所述遗传转化体系进行遗传转化或基因编辑，获得的转化再生植株或基因编辑植株可以实现基因功能的验证，且所述遗传转化或基因编辑方法，无需无菌环境培育无菌苗，并且免除愈伤组织的诱导及组织培养的过程，简化实验操作，降低实验成本。降低实验成本。降低实验成本。

【技术实现步骤摘要】
一种芸香科植物的遗传转化体系、遗传转化方法和应用


[0001]本专利技术属于遗传转化
，具体涉及一种芸香科植物的遗传转化体系、遗传转化方法和应用。

技术介绍

[0002]遗传转化方法根据目的基因进入宿主细胞的方式可以分为载体介导目的基因转移系统和目的基因直接导入系统。其中，前者包括农杆菌介导法和病毒介导法，后者包括基因枪法、电击法、超声波法、显微注射法、花粉管通道法、PEG(聚乙二醇)法等。农杆菌又分为根癌农杆菌和发根农杆菌两种。已有研究表明，根癌农杆菌介导的遗传转化，因为其转化率较高且重复性较好已经成为植物遗传转化中最常规、最广泛的基因转化途径。
[0003]农杆菌转化一般要经过以下几个过程：材料选择、预培养、共培养、筛选培养和植株再生。农杆菌转化法以植物的离体再生技术为依托，常选用的外植体包括胚轴、茎、叶片等。一般情况下要先对种子消毒，培养出相应材料的无菌苗，然后再选择合适的外植体进行下一步。该方法下选择的外植体需具有成熟的离体再生体系。整个转化过程耗时长，组培期间容易被细菌、真菌污染。此外，受体材料需对选择性抗生素敏感、对抑菌性抗生素不敏感以保证在农杆菌侵染受体后的脱菌以及后续筛选阳性植株阶段能够顺利进行；受体材料需能接受外源基因整合并可稳定遗传，在目的基因的表达过程中应避免宿主发生变异才有可能获得有目标性状的转基因植株。此外，组织培养中外植体常出现褐化的现象，由于伤流从外植体剪口处大量流出，其中的酚类物质在多酚氧化酶的作用下氧化成为醌类物质，从而对外植体产生毒害，造成外植体的死亡。
[0004]目前，在MS培养基中生长4周的柑橘实生苗上胚轴是较为理想的柑橘遗传转化受体材料。因对上胚轴进行遗传转化需通过组培以进行共培养、筛选培养、芽诱导、根诱导等环节，因此获得40cm高的植株往往需要半年甚至更久。此外，用该方法获得的大部分柑橘品种的基因编辑植株童期往往在3
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5年，这给研究人员对柑橘花、果、种性状相关调控基因的研究增加了极大时间成本。
[0005]发根农杆菌是根瘤菌科农杆菌属的一种革兰氏阴性土壤细菌，可侵染大多数双子叶植物、部份单子叶植物及个别的裸子植物，诱发被感染植物的受伤部位长出毛状根。发根农杆菌之所以具有这种致根性，是因为它具有能诱导毛状根产生的Ri质粒。Ri质粒是发根农杆菌染色体外的一个约250kb的大质粒，带有冠瘿合成酶基因。在Ri质粒上，存在与转化有关的两个主要功能区，即T
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DNA(转移区)和Vir(致病区)。Vir区基因并不发生转移，但它对T
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DNA的转移非常重要。当发根农杆菌感染植物时Ri质粒上的T
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DNA可以转化并插入到植物细胞基因组中，其整合和表达的结果导致了大量毛状根的产生。
[0006]目前，发根农杆菌介导的植物转基因绝大数是利用植株的无菌苗或叶片或茎段作为外植体获得转基因根。农杆菌介导植株转基因方法的应用大多集中在茄科、菊科、十字花科、旋花科、伞形科、豆科、石竹科、蓼科等草本植物中广泛应用，而在木本植物中的应用普遍存在转化率较低的现象。常规的发根农杆菌介导转基因植物的构建方法大多以无菌材料
为侵染对象，需要大量的时间进行愈伤组织诱导、分化和继代，周期长，操作繁琐，效率低。而木本植物大多次生代谢物较多，组培过程中易发生褐化，严重影响外植体的脱分化和培养物的再分化进程。其次木本植物组培苗时间较草本植物长，成本高，技术要求严。

技术实现思路

[0007]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种芸香科植物的遗传转化体系、遗传转化方法和应用，不仅可跳过繁琐的组培环节，从而提高遗传转化效率，还具备在成株上进行操作的可行性，为缩短花、果、种等表型相关基因功能研究的周期提供了可能。
[0008]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0009]本专利技术提供了一种芸香科植物的遗传转化体系，所述遗传转化体系以发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)K599介导，以芸香科植物的枝条为转化材料。
[0010]本专利技术还提供了一种芸香科植物的遗传转化方法，包括以下步骤：将待转的基因转入发根农杆菌K599的感受态细胞中，挑取阳性菌株经培养后提取菌体，利用MES浸润液重悬所述菌体至OD值为0.6
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1.0，于黑暗条件下放置3h，得介导液；
[0011]将芸香科植物的枝条底部完全浸入所述介导液中真空浸润10
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30min，得浸润枝条；
[0012]将所述浸润枝条扦插后生根，得遗传转化芸香科植株。
[0013]优选的，所述待转的基因包括用于基因编辑的Cas9质粒。
[0014]优选的，所述Cas9质粒包括1380
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Cas9
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HA，所述1380
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Cas9
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HA的核苷酸序列如SEQ ID NO.66所示。
[0015]优选的，所述阳性菌株包括经Kana和Str两种抗生素筛选、菌液PCR和测序均显示阳性的菌株。
[0016]优选的，所述阳性菌株的培养包括在包含50mg/L Kana和50mg/L Str的TY培养基上进行培养。
[0017]优选的，所述枝条的长度为8～12cm，并携带1～2片叶，每片叶保留1/3面积。
[0018]优选的，所述扦插的基质包括蛭石，并保持温度26～30℃。
[0019]优选的，在所述生根后，还包括对生根植株进行遗传转化的检测。
[0020]本专利技术还提供了上述遗传转化体系在免组培的芸香科植物基因编辑中的应用。
[0021]有益效果：本专利技术提供了一种以发根农杆菌K599介导的，直接对芸香科植物的枝条进行遗传转化的遗传转化体系。本专利技术所述遗传转化体系以柑橘枝条为转化材料，具有获取方便、数量多、成本低、无季节限制等优点，有效克服了农杆菌转化法的诸多缺陷；发根农杆菌K599介导的遗传转化体系周期为14～28天，节省时间，有效缩短柑橘基因功能研究周期；发根农杆菌K599诱导的毛状根由单个细胞发育而来，遗传稳定性高，可以避免嵌合体的形成。利用本专利技术所述遗传转化体系进行遗传转化或基因编辑，获得的转化再生植株或基因编辑植株可以实现基因功能的验证，且所述遗传转化或基因编辑方法，无需无菌环境培育无菌苗，并且免除了愈伤组织的诱导及组织培养的过程，简化了实验操作，降低了实验成本。
附图说明
[0022]图1为遗传转化的具体方法流程；
[0023]图2为1380
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Cas9
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HA质粒图谱；
[0024]图3为随机选择基因的20个gRNA初始载体；
[0025]图4为1380
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Cas9
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HA浸润香橼荧光对照图，其中未经浸润直接扦插的野生型对照在激发光照射下无荧光，而经1380
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Cas9
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HA浸润的香橼在激发光照射下能够看到绿本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种芸香科植物的遗传转化体系，所述遗传转化体系以发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)K599介导，以芸香科植物的枝条为转化材料。2.一种芸香科植物的遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：将待转的基因转入发根农杆菌K599的感受态细胞中，挑取阳性菌株经培养后提取菌体，利用MES浸润液重悬所述菌体至OD值为0.6
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1.0，于黑暗条件下放置3h，得介导液；将芸香科植物的枝条底部完全浸入所述介导液中真空浸润10
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30min，得浸润枝条；将所述浸润枝条扦插后生根，得遗传转化芸香科植株。3.根据权利要求2所述遗传转化方法，其特征在于，所述待转的基因包括用于基因编辑的Cas9质粒。4.根据权利要求3所述遗传转化方法，其特征在于，所述Cas9质粒包括1380
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Cas9
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H...

【专利技术属性】
技术研发人员：孟心月，马海杰，刘金华，张瑞峰，毛雄兴，孙学鹏，段硕，
申请(专利权)人：浙江养生堂天然药物研究所有限公司赣南师范大学，
类型：发明
国别省市：