用于改变植物中生物碱含量的方法技术

本发明专利技术涉及用于调节植物或其部分的生物碱含量的方法，所述方法包括通过调节编码RNA结合蛋白的至少一种基因的活性或表达来修饰所述植物。本发明专利技术还涉及降低烟草中的至少一种烟草特有亚硝胺（TSNA）前体的含量的方法，所述方法包括调节编码RNA结合蛋白的至少一种基因的活性或表达。的活性或表达。的活性或表达。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于改变植物中生物碱含量的方法


[0001]本专利技术涉及调节植物或其部分或细胞或细胞培养物的生物碱含量的方法。本专利技术还扩展到调节多肽的表达和/或活性的方法，所述多肽调节植物内的生物碱含量。另一方面，本专利技术提供了调节基因表达和/或活性的方法，所述基因编码调节植物内的生物碱含量的多肽。本专利技术还扩展到可以用于调节多肽的构建体。本专利技术进一步涉及被修饰以实现生物碱含量的调节的植物细胞和植物。本专利技术还涉及来自这种调节的植物的加工和收获的叶片及其在烟草工业产品中的用途，包括可燃吸烟制品。

技术介绍

[0002]生物碱是一组天然存在的化合物，其主要含有碱性氮原子，并且由大量各种生物包括细菌、真菌、植物和动物产生。
[0003]生物碱可以根据碳骨架例如吲哚、异喹啉和吡啶样的相似性进行分类。吡啶衍生物是一类单体生物碱；这个类别包括简单的吡啶衍生物、多环缩合和非缩合吡啶衍生物以及倍半萜吡啶衍生物。实例是尼古丁、降烟碱、假氧尼古丁（pseudooxynicotine）、新烟碱、米喔斯明和新烟草碱。
[0004]生物碱的大多数已知的生物学功能都与保护相关。神经活性分子如咖啡因、柯卡因、吗啡和尼古丁，充当针对侵入的捕食者的防御化合物。这些生物碱的累积是监控基因表达、酶活性和生物碱浓度的信号转导级联的结果。植物中的生物碱含量的精细调节涉及负反馈环和降解途径。
[0005]尼古丁天然存在于几个植制品种中，但在烟草植物中以最高水平发现。栽培烟草产生总干重2
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4%的生物碱。尼古丁在野生和栽培烟草属（Nicotiana）物种中产生，并且在针对食草动物和昆虫的植物防御中起重要作用（Voelckel等人(2001) Oecologia 127(2): 274
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280，引入本文作为参考）。其占总生物碱含量的~90%。剩余10%的生物碱库主要由结构上有关的化合物降烟碱、新烟草碱、新烟碱和假氧尼古丁（PON）构成。
[0006]烟草中生物碱含量的调节是复杂的。几种因素包括基因型、环境、施肥和农学实践（例如打顶）影响烟草植物中的生物碱水平。尼古丁生物合成的一些关键调节物是充分表征的，例如在这个途径中起关键作用的腐胺N
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甲基转移酶（PMT）被乙烯应答因子（ERF）超家族
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烟草基因组中最大的转录因子家族
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的成员激活（引入本文作为参考的Rushton等人(2008) Plant Physiol. 147(1): 280
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295）。诱导生物碱生物合成的其它转录因子属于MYC2
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样碱性螺旋
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环
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螺旋（bHLH）家族。MYC2
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样bHLHs通过Gbox
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介导的生物碱结构基因的结合和激活直接调节生物碱水平，并且通过ERFs的激活间接调节生物碱水平。
[0007]烟草吡啶生物碱是在收获后的叶片调制（curing）过程中形成的烟草特有亚硝胺（TSNAs）的前体。在调制后的烟草叶片中发现的四种主要的TSNAs是N'
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亚硝基降烟碱（NNN）、N'
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亚硝基新烟草碱（NAT）、N'
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亚硝基新烟碱（NAB）和4
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(甲基亚硝胺基)
‑1‑
(3
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吡啶基)
‑1‑
丁酮（NNK）。在收获后的叶片调制过程中，吡啶生物碱与亚硝化种类之间的反应导致烟草特有亚硝胺（TSNAs）的形成。PON可能起TSNA NNK合成中的直接前体的作用（引入本文
作为参考的Bush等人, 2001）。减少TSNAs的产生和累积具有重要意义。尼古丁脱甲基酶基因的CYP82E家族是尼古丁向降烟碱转化的主要调节物之一，并且改变其活性或累积可能导致NNN水平降低。然而，迄今为止，尚未鉴定出负责产生PON的酶或基因。
[0008]如实施例中所述的，专利技术人设法研究负责生物碱和/或TSNA前体合成的基因，目的是调节植物中的生物碱含量，例如降低烟草中的TSNA含量。

技术实现思路

[0009]已令人惊奇地发现，通过调节编码RNA结合蛋白的基因的活性或表达，可以调节植物的生物碱含量和/或TSNA含量或TSNA的前体含量。如本文教导的编码RNA结合蛋白的基因，例如Nitab4.5_0013685g0010.2，是栽培烟草中生物碱和TSNA前体含量的调节物。特别地，如本文所教导的基因，例如Nitab4.5_0013685g0010.2，是栽培烟草中生物碱含量的调节物。Nitab4.5_0013685g0010.2编码根据本专利技术的RNA结合蛋白。Nitab4.5_0000308g0150.2、Nitab4.5_0003919g0010.2、Nitab4.5_0002978g0020.2、Nitab4.5_0001361g0220.2、Nitab4.5_0002978g0030.2、Nitab4.5_0001361g0225.2、Nitab4.5_0003978g0020.2、Nitab4.5_0000078g0240.2、Nitab4.5_0005079g0050.2、Nitab4.5_0008185g0030.2是根据本专利技术的Nitab4.5_0013685g0010.2的同源物。
[0010]根据本专利技术的RNA结合蛋白可含有称为RNA结合结构域（RBD）和RGG结构域的保守结构域。
[0011]根据本专利技术，可以生产具有调节的生物碱含量以及由烟草工业产品的消费者所追求的商业上期望性状的烟草工业产品。在一些情况下，消费者可能期望具有低水平的生物碱含量的产品。在一些情况下，消费者可能期望具有低水平的TSNA前体的产品。
[0012]本专利技术可能在植物分子农业领域中特别有用，其中植物（例如烟草和其它烟草属物种）用于生产蛋白、肽和代谢物，例如用于生产治疗剂和药物如抗生素、病毒样颗粒、或营养药（neutraceuticals）或小分子。在EU提供资金的名为PharmPlant的项目中，烟草已用于开发HIV
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中和抗体，并且加拿大的Medicago Inc.已参与基于烟草的平台，用于生产用于流感疫苗制造的病毒样颗粒。
[0013]因此，根据本专利技术的植物可以用于分子农业，以减少或消除尼古丁生物碱的存在。低尼古丁植物或根状茎（rootsock）的使用在分子农业中是有益的，并且将减少与纯化有关的下游加工成本。
[0014]本专利技术人已令人惊讶地确定了通过调节（例如降低）编码RNA结合蛋白的基因的活性或表达用于调节（例如降低）植物（例如烟草植物）的生物碱含量的方法。植物（例如烟草植物）的生物碱含量（例如降烟碱、PON、新烟碱、新烟草碱或米喔斯明中的一种或多种的含量，适当地降烟碱、PON、新烟碱或新烟草碱中的一种或多种的含量）可通过降低编码RNA结合蛋白的基因的活性或表达来降低，或者可以通过增加编码RNA结合蛋白的基因的活本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.调节（例如降低）烟草植物或其部分或烟草细胞或烟草细胞培养物的生物碱含量的方法，所述方法包括通过降低编码RNA结合蛋白的至少一种基因的活性或表达来修饰所述植物或其部分或细胞，所述RNA结合蛋白具有如SEQ ID NO.1、4、7、10、13、16、19、22、25、28或31所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO. 1、4、7、10、13、16、19、22、25、28或31具有至少80%同一性的序列。2.降低烟草植物或其部分或烟草细胞或烟草细胞培养物中的烟草特有亚硝胺（TSNA）前体含量的方法，所述方法包括通过降低编码RNA结合蛋白的至少一种基因的活性或表达来修饰所述植物或其部分或细胞，所述RNA结合蛋白具有如SEQ ID NO.1、4、7、10、13、16、19、22、25、28或31所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO. 1、4、7、10、13、16、19、22、25、28或31具有至少80%同一性的序列。3.编码具有如SEQ ID NO.1、4、7、10、13、16、19、22、25、28或31所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO. 1、4、7、10、13、16、19、22、25、28或31具有至少80%同一性的序列的RNA结合蛋白的至少一种基因用于在烟草细胞或烟草植物或其部分或烟草细胞培养物中调节（例如降低）生物碱含量或降低TSNA前体含量的用途。4.用于生产具有调节的（例如降低的）生物碱含量或降低的TSNA前体含量的植物或其部分、烟草细胞或烟草细胞培养物、植物繁殖材料、叶片、切割的收获的叶片、加工叶片或切割且加工的叶片的方法，所述方法包括修饰所述植物或其部分或细胞或细胞培养物或植物繁殖材料，以降低编码RNA结合蛋白的至少一种基因的活性或表达，所述RNA结合蛋白具有如SEQ ID NO.1、4、7、10、13、16、19、22、25、28或31所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO. 1、4、7、10、13、16、19、22、25、28或31具有至少80%同一性的序列。5.根据前述权利要求任一项的方法或用途，其中与尚未经修饰以降低编码所述RNA结合蛋白的至少一种基因的活性或表达的植物或其部分或细胞或细胞培养物或植物繁殖材料或叶片相比，生物碱含量或TSNA前体含量降低，所述RNA结合蛋白具有如SEQ ID NO.1、4、7、10、13、16、19、22、25、28或31所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO. 1、4、7、10、13、16、19、22、25、28或31具有至少80%同一性的序列。6.植物或其部分或细胞或细胞培养物，其已进行修饰，以实现与未修饰的植物或其部分或未修饰的细胞培养物相比，在生物碱含量中的调节（例如降低）或TSNA前体含量的降低，其中所述修饰是编码RNA结合蛋白的至少一种基因的活性或表达的降低，所述RNA结合蛋白具有如SEQ ID NO.1、4、7、10、13、16、19、22、25、28或31所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO. 1、4、7、10、13、16、19、22、25、28或31具有至少80%同一性的序列。7.植物繁殖材料，其从根据权利要求6的植物或者从通过权利要求1、2、4或5的方法生产的植物或细胞培养物可获得（例如获得）。8.根据权利要求1
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5任一项的方法或用途、根据权利要求6的植物或其部分或细胞培养物或根据权利要求7的植物繁殖材料，其中所述TSNA前体选自降烟碱、PON、新烟碱和新烟草碱，优选地所述TSNA前体是降烟碱。9.根据权利要求6或8任一项的植物或其部分或细胞培养物、或者通过权利要求1、2、4、5或8中任一项的方法生产的植物培育植物的用途。10.根据权利要求6或8任一项的植物或其部分或细胞培养物、或者通过权利要求1、2、4、5或8中任一项的方法生产的植物用于生产产品的用途。
11.根据权利要求6或8中任一项的植物或其部分、或者通过权利要求1、2、4、5或8中任一项的方法生产的植物种植作物的用途。12.根据权利要求6或8中任一项的植物或其部分、或者通过权利要求1、2、4、5或8中任一项的方法生产的植物生产叶片的用途。13.收获的叶片，其是根据权利要求6或8的植物的、或者可得自（例如得自）从根据权利要求7的繁殖材料繁殖的植物、或者可得自（例如得自）通过根据权利要求3或9
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12中任一项的用途获得的植物、或者可得自（例如得自）通过权利要求1、2、4、5或8中任一项的方法生产的植物。14.根据权利要求13的植物的收获的叶片，其中所述植物的收获的叶片是切割的收获的叶片。15.加工叶片，优选加工烟草叶片，优选不能存活的加工烟草叶片，其：可得自（例如得自）从根据权利要求3或9
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12中任一项的用途可获得（例如获得）的植物；通过加工根据权利要求6或8中任一项的植物可获得（例如获得）；可得自（例如得自）从根据权利要求7的植物繁殖材料繁殖的植物；或通过加工根据权利要求13或14的收获的叶片可获...

【专利技术属性】
技术研发人员：S，
申请(专利权)人：英美烟草投资有限公司，
类型：发明
国别省市：