一种柱花草的遗传转化方法技术

本发明专利技术公开了一种柱花草的遗传转化方法。本发明专利技术所述遗传转化方法为斜切柱花草幼苗的下胚轴，在地上部的下胚轴斜切面处涂布携带有目的基因的重组发根农杆菌，将幼苗移植于土壤基质中并加入携带有目的基因的重组发根农杆菌菌液完成侵染，将幼苗培养至第二对三出复叶完全展开，并长出新的根系，新长出的地下部部分即为转基因柱花草。本发明专利技术所述柱花草遗传转化方法操作简便，成本低，不需在无菌环境中进行，也不需要利用培养基进行诱导培养，遗传转化效率在85％以上，且耗时短，20天即可获得转化后的柱花草，克服了现有柱花草遗传转化方法耗时长，遗传转化效率低的问题。遗传转化效率低的问题。遗传转化效率低的问题。

【技术实现步骤摘要】
一种柱花草的遗传转化方法


[0001]本专利技术属于植物的遗传转化
更具体地，涉及一种柱花草的遗传转化方法。

技术介绍

[0002]柱花草(Stylosanthes spp.)是一种重要的热带豆科植物，起源于巴西和哥伦比亚，其适应性强，产量高且富含蛋白质，在世界热带地区被广泛利用。柱花草既可用作饲草喂养牲畜，也可以用于豆科绿肥植物、人工草地建设、天然草地改良和林果草生态工程建设等。随着研究技术手段的发展，柱花草在生态学、生理生化特性、遗传多样性和转基因等方面开展了较多研究。然而，由于存在着可利用资源少和遗传能力弱等限制因素，严重制约了柱花草深入研究的开展。为解决在柱花草中存在的上述问题，最有效的手段就是通过生物技术方法对柱花草进行遗传改良。
[0003]目前，转基因柱花草的获得主要是通过根癌农杆菌介导的遗传转化方法。然而，柱花草是一种难以被根癌农杆菌介导转化的豆科植物，根癌农杆菌介导的柱花草遗传方法的转化效率低、耗时长、成本高，严重制约了柱花草深入研究的开展。除根癌农杆菌介导的遗传转化方法外，中国专利CN113604498A中利用发根农杆菌实现了对柱花草毛状根的诱导，但其诱导率仍不够高，仅58.3％，且诱导过程操作繁琐，对培养环境的要求高，需在无菌条件下培养。

技术实现思路

[0004]本专利技术要解决的技术问题是克服现有上述技术的缺陷和不足，提供一种操作简便、耗时短、遗传转化效率高的柱花草遗传转化方法。
[0005]本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：
[0006]本专利技术利用携带β
‑
葡萄糖苷酸酶(GUS)报告基因质粒的重组发根农杆菌，通过侵染柱花草下胚轴后培养并检测，成功构建了一种操作简便、耗时短、遗传转化效率高的柱花草遗传转化方法。
[0007]本专利技术所述柱花草的遗传转化方法包含以下步骤：
[0008]S1.取柱花草幼苗，斜切幼苗下胚轴，取地上部待用；
[0009]S2.在地上部的下胚轴斜切面处涂布携带有目的基因的重组发根农杆菌，随后将柱花草地上部移植于土壤基质中，同时在土壤移植处加入携带有目的基因的重组发根农杆菌菌液，完成侵染；
[0010]S3.将完成侵染的柱花草幼苗培养至第二对三出复叶完全展开，并长出新的根系，新长出的地下部部分即为转化后的柱花草。
[0011]具体地，步骤S1中所述柱花草幼苗为生长3～12d的幼苗。
[0012]优选地，所述幼苗为生长了6～9d的幼苗。
[0013]具体地，步骤S1中斜切下胚轴时，在距柱花草子叶节下0.7～1.5cm处斜切断下胚
轴。
[0014]优选地，在距柱花草子叶节下0.7cm处斜切断下胚轴。
[0015]具体地，步骤S2中所用发根农杆菌菌株为K599、Arqual、MSU440或C58C1。
[0016]优选地，所用发根农杆菌菌株为K599、Arqual或C58C1。
[0017]具体地，步骤S2中所用发根农杆菌菌液的OD600值为0.8～1.0，加入的菌液的体积为0.3～0.6mL。
[0018]优选地，所述发根农杆菌菌液的OD600值为1.0，加入的菌液的体积为0.5mL。
[0019]具体地，步骤S3中所述柱花草幼苗在用保鲜膜包裹后，再放入光照培养箱中培养，培养温度为24～26℃，光照强度为80μmol m
‑2s
‑1，16h光照/8h黑暗。
[0020]具体地，所述柱花草的品种为“热研5号”圭亚那柱花草(Stylosanthes guianensis)。
[0021]本专利技术具有以下有益效果：
[0022]本专利技术所述柱花草的遗传转化方法操作简便，成本低，对环境要求低，不需在无菌环境中进行，也不需要利用培养基进行诱导培养，遗传转化效率在85％以上，且耗时短，20天即可获得转化后的柱花草，克服了现有柱花草遗传转化方法耗时长，遗传转化效率低的问题。
附图说明
[0023]图1为本专利技术所述柱花草遗传转化方法的过程图；其中，图A为培养的柱花草幼苗；图B
‑
C为斜切柱花草幼苗下胚轴；图D
‑
E为在下胚轴斜切面处涂布携带有目的基因的重组发根农杆菌；图F为在土壤移植处加入携带有目的基因的重组发根农杆菌菌液；图G为保鲜膜包裹的柱花草幼苗；图H为培养所得的转化后的柱花草；图I为转化后的柱花草的GUS染色结果。
[0024]图2为转基因柱花草中标记基因的检测结果；其中，图A为用9d苗期柱花草遗传转化所得转基因柱花草中标记基因的PCR检测结果；图B为用9d苗期柱花草遗传转化所得转基因柱花草中标记基因表达情况的检测结果。
[0025]图3为不同处理对柱花草遗传转化效率的影响；其中，图A为不同苗期对柱花草转基因植株遗传转化效率的影响结果；图B为斜切不同下胚轴位置对柱花草转基因植株遗传转化效率的影响结果；图C为使用不同发根农杆菌菌株对柱花草转基因植株遗传转化效率的影响结果。
具体实施方式
[0026]以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本专利技术，但实施例并不对本专利技术做任何形式的限定。除非特别说明，本专利技术采用的试剂、方法和设备为本
常规试剂、方法和设备。
[0027]除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
[0028]本专利技术所用柱花草材料为“热研5号”圭亚那柱花草(Stylosanthes guianensis)，所述柱花草的种子保存于中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所。
[0029]本专利技术使用的6种发根农杆菌菌株分别为：K599、ArA4、Ar1193、Arqual、MSU440和
C58C1。
[0030]本专利技术转染发根农杆菌所用质粒为pTF102载体，其携带有β
‑
葡萄糖苷酸酶(GUS)报告基因。
[0031]本专利技术所述Hoagland营养液配方中含有3mM KNO3、2mM Ca(NO3)2、0.25mΜ KH2PO4、0.5mM MgSO4、5μM MnSO4、0.5μM ZnSO4、1.5μM CuSO4、0.09μM(NH4)6Mo7O
24
、23μM NaB4O7和80μM Fe
‑
Na
‑
EDTA(pH 5.8)。
[0032]本专利技术所用土壤基质为德国K牌422泥炭土(pH 6.0)。
[0033]本专利技术所述TY培养基中含有8g/L Tryptone、5g/L Yeast Extract、5g/L NaCl和15g/L琼脂(液体培养基不需要添加)。
[0034]GUS染色液由上海源叶生物科技有限公司提供。
[0035]DNA提取试剂盒由北京天根生化科技有限公司提供。
[0036]普通PCR试剂(2
×
Rapid Taq Master Mix)和反转录试剂(HiScript III 1st Strand cDNA 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种柱花草的遗传转化方法，其特征在于，包含以下步骤：S1.取柱花草幼苗，斜切幼苗下胚轴，取地上部待用；S2.在地上部的下胚轴斜切面处涂布携带有目的基因的重组发根农杆菌，随后将柱花草地上部移植于土壤基质中，同时在土壤移植处加入携带有目的基因的重组发根农杆菌菌液，完成侵染；S3.将完成侵染的柱花草幼苗培养至第二对三出复叶完全展开，并长出新的根系，新长出的地下部部分即为转化后的柱花草。2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S1中所述柱花草幼苗为生长3～12d的幼苗。3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S1中斜切下胚轴时，在距柱花草子叶节下0.7～1.5cm处斜切断下胚轴。4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S2中所用发根农杆菌菌株为K599、Arqual、MSU440或C58C1。5.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈志坚，王林杰，董荣书，李欣勇，刘攀道，刘国道，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，
类型：发明
国别省市：