一种激素诱导日本鳗鲡卵巢发育效果的评价方法技术

本发明专利技术公开了一种激素诱导日本鳗鲡卵巢发育效果的评价方法。上述方法包括以下步骤：S1选取雌性日本鳗鲡，提供非变性哺乳动物蛋白抽提液、FITC、hCG。S2获取含有卵黄蛋白原的血清。S3得到纯化卵黄蛋白原。S4耦合标记处理，验证纯化效果。S5设置实验验证目的激素能否促进卵黄蛋白原进入卵母细胞，从而有效诱导日本鳗鲡卵巢发育。S6在荧光显微镜下观察实验组的荧光强度，基于Western Blot验证目的激素能否促进卵黄蛋白原进入卵母细胞，评价诱导发育效果。本发明专利技术基于判断目的激素能否促进卵黄蛋白原进入卵母细胞，从而有效诱导日本鳗鲡卵巢发育，对准确评价新型催熟剂诱导卵黄堆积的效果具有重要意义，从而为研究日本鳗鲡的人工繁殖提供技术支撑。提供技术支撑。提供技术支撑。

【技术实现步骤摘要】
一种激素诱导日本鳗鲡卵巢发育效果的评价方法


[0001]本专利技术涉及鱼类生理学研究
，特别是涉及一种激素诱导日本鳗鲡卵巢发育效果的评价方法。

技术介绍

[0002]日本鳗鲡(Anguillajaponica)是亚洲最重要的洄游性鱼类之一，也是我国重要的经济鱼类。由于日本鳗鲡生活史的特殊性，其人工繁殖技术是至今尚未解决的世界性难题，人工养殖所需的苗种一直依靠天然捕捞供给。20世纪80年代后，伴随着鳗鲡养殖业的迅速发展，我国已成为世界上鳗鲡养殖产业化程度最高的国家之一，但是由于养殖所需的苗种全部依靠天然捕捞，这种掠夺式的养殖方式致使天然鳗苗资源逐年下降，鳗苗苗种的短缺限制了鳗鲡产业的进一步发展。因此，开展鳗鲡人工繁殖技术研究对保护天然资源和养鳗产业的可持续发展尤为重要。
[0003]鳗鲡的人工繁殖始于20世纪30年代。1934年，Boucher等首次人工诱导雄性欧洲鳗鲡精巢发育成熟。1964年，Fontaine等诱导雌性欧洲鳗鲡排卵。1978年Epler等用同样的方法诱导欧洲鳗鲡产卵，并获得了早期的胚胎。20世纪60年代，日本学者开始了对日本鳗鲡人工繁殖的研究工作。1970年Ishida等首次诱导日本鳗鲡卵巢发育成熟并排卵。1972，Yamamoto等获得了第一批仔鳗，尽管存活了120天后死亡，这在世界尚属首次。直到1999年，Tanaka等采用以鲨鱼卵冷冻干燥粉末作为日本鳗鲡育苗饲料的主要成分，获得重大突破，使人工孵化的仔鳗存活了253天。2003年，日本水产研究所再次报道人工孵化的鳗鲡存活时间达到612天，最大个体体长超过20cm。2010年3月，日本水产厅下属的水产综合研究中心对50尾亲鳗注射激素催熟后，获得25万颗受精卵，至4月下旬存活的仔鱼仅为1万尾。鳗鲡人工繁殖技术虽然取得了显著进展，但是离产业化大规模繁育生产鳗苗的需求还有很大距离，主要由于是目前人工催熟亲鳗的成熟率、产卵率和产卵量还比较低，特别是产出的卵子质量并不理想，致使受精率、孵化率和成活率很低，而孵出的鳗苗虽然最终可以经过变态成长为白仔鳗苗，但生长速度十分缓慢，成活率极低，且畸形率高。除上述不足之外，人工培育的开口饵料、养殖培育等费用高达数千美元/每尾，如此高昂的成本是产业化的致命限制。解决这些问题的核心，在于如何提高人工繁殖鳗鲡的卵子质量，需进行系统深入的研究和试验。
[0004]为探究提高卵子质量的方案，首先需要建立优质健康卵子的评价标准。然而，目前鱼类卵子质量的评价方法多限于对卵细胞的表型数据(如直径的测量)的观察，而对其内在的营养成分，特别是卵黄蛋白(vitellogenin，VTG)这一胚胎及胚后发育最为重要的营养物质入卵量的评价方法仍属空白。另一方面，作为卵子发生过程中最为重要的阶段，卵黄生成作用对于成熟卵子的质量具有决定性作用，对这一阶段的实时监测可以更为直观地判断卵子发生的具体状态。因此，开发卵黄蛋白摄入量的检测技术可以应用于卵子质量的评估，尤其是对于准确评价新型催熟剂诱导卵黄堆积的效果具有重要意义。

技术实现思路

[0005]基于此，有必要针对当下卵黄蛋白摄入量检测技术空白的问题，提供一种激素诱导日本鳗鲡卵巢发育效果的评价方法。
[0006]一种激素诱导日本鳗鲡卵巢发育效果的评价方法，包括以下步骤：
[0007]S1选取雌性日本鳗鲡，提供雌二醇、1
×
PBS缓冲液、非变性哺乳动物蛋白抽提液、FITC；
[0008]S2先对所述雌性日本鳗鲡注射所述雌二醇，获取含有卵黄蛋白原的血清；
[0009]S3所述含有卵黄蛋白原的血清经所述1
×
PBS缓冲液和所述非变性哺乳动物蛋白抽提液纯化处理后，得到纯化卵黄蛋白原；
[0010]S4使用所述FITC对所述纯化卵黄蛋白原进行耦合标记处理，基于SDS
‑
PAGE电泳验证纯化效果；
[0011]S5设置实验来进行目的激素能否有效诱导日本鳗鲡卵巢发育的验证；
[0012]所述验证方法，其具体操作如下：
[0013]S51取所述雌性日本鳗鲡的卵巢组织，处理后置于24孔细胞培养板中，加入培养基进行培养；
[0014]S52设置对照实验，根据实验要求选择是否向细胞培养板中加入目的激素和FITC标记的卵黄蛋白原；
[0015]所述对照实验的设置如下：
[0016]实验组1：加入无FITC标记的卵黄蛋白原；
[0017]实验组2：加入目的激素和无FITC标记的卵黄蛋白原；
[0018]实验组3：加入FITC标记的卵黄蛋白原；
[0019]实验组4：加入目的激素和FTTC标记的卵黄蛋白原；
[0020]实验组5：不添加目的激素和FITC标记的卵黄蛋白原；
[0021]每组设置三个重复；
[0022]S6在荧光显微镜下观察所述实验组的荧光强度，基于Western Blot验证目的激素能否促进卵黄蛋白原进入卵母细胞，评价诱导发育效果。
[0023]上述评价方法，基于日本鳗鲡卵母细胞在含有目的激素(hCG)和FITC耦合标记的卵黄蛋白原的混合培养基中进行培养的模式，结合荧光显微镜观察以及Western Blot验证的方式，判断目的激素(hCG)能否促进卵黄蛋白原进入卵母细胞，从而有效诱导日本鳗鲡卵巢发育，对准确评价新型催熟剂诱导卵黄堆积的效果具有重要意义，从而为研究日本鳗鲡的人工繁殖提供技术支撑。
[0024]在其中一个实施例中，所述雌性日本鳗鲡的选取标准如下：体质健壮，体重为1
±
0.2
㎏
；所述非变性哺乳动物蛋白抽提液具备如下组分：50mM NaH2PO4，300mM NaCl，0.05％Tween 20。
[0025]进一步地，所述非变性哺乳动物蛋白抽提液用NaOH调节pH值至8.0。
[0026]在其中一个实施例中，所述获取卵黄蛋白原的方法，其具体操作如下：
[0027]S21对所述雌性日本鳗鲡注射所述雌二醇；
[0028]S22抽取所述日本鳗鲡的血液，经静置离心后，吸取含有卵黄蛋白原的血清。
[0029]进一步地，所述雌二醇的注射标准为：每两天注射一次，注射剂量为10mg/
㎏
，连续
注射两周。
[0030]在其中一个实施例中，所述纯化处理的方法，其具体操作如下：
[0031]S31提供超滤管、灭菌超纯水；
[0032]S32向所述超滤管中加满所述灭菌超纯水，冰上预冷10min，倒掉超纯水；
[0033]S33加入1
×
PBS缓冲液，离心后弃去滤液；
[0034]S34加入所述含有卵黄蛋白原的血清，离心后弃去滤液；
[0035]S34继续加入所述非变性哺乳动物蛋白抽提液，多次离心处理，弃去滤液，得到纯化卵黄蛋白原。
[0036]进一步地，经过纯化之后，绝大多数杂蛋白透过滤膜被过滤掉，后进行SDS
‑
PAGE电泳和本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种激素诱导日本鳗鲡卵巢发育效果的评价方法，其特征在于，包括以下步骤：S1选取雌性日本鳗鲡，提供雌二醇、1
×
PBS缓冲液、非变性哺乳动物蛋白抽提液、FITC；S2先对所述雌性日本鳗鲡注射所述雌二醇，获取含有卵黄蛋白原的血清；S3所述含有卵黄蛋白原的血清经所述1
×
PBS缓冲液和所述非变性哺乳动物蛋白抽提液纯化处理后，得到纯化卵黄蛋白原；S4使用所述FITC对所述纯化卵黄蛋白原进行耦合标记处理，基于SDS
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PAGE电泳验证纯化效果；S5设置实验来进行目的激素能否有效诱导日本鳗鲡卵巢发育的验证；所述验证方法，其具体操作如下：S51取所述雌性日本鳗鲡的卵巢组织，处理后置于24孔细胞培养板中，加入培养基进行培养；S52设置对照实验，根据实验要求选择是否向细胞培养板中加入目的激素和FITC标记的卵黄蛋白原；所述对照实验的设置如下：实验组1：加入无FITC标记的卵黄蛋白原；实验组2：加入目的激素和无FITC标记的卵黄蛋白原；实验组3：加入FITC标记的卵黄蛋白原；实验组4：加入目的激素和FTTC标记的卵黄蛋白原；实验组5：不添加目的激素和FITC标记的卵黄蛋白原；每组设置三个重复；S6在荧光显微镜下观察所述实验组的荧光强度，基于Western Blot验证目的激素能否促进卵黄蛋白原进入卵母细胞，评价诱导发育效果。2.根据权利要求1所述的一种激素诱导日本鳗鲡卵巢发育效果的评价方法，其特征在于，所述雌性日本鳗鲡的选取标准如下：体质健壮，体重为1
±
0.2
㎏
；所述非变性哺乳动物蛋白抽提液具备如下组分：50mM NaH2PO4，300mM NaCl，0.05％Tween 20。3.根据权利要求2所述的一种激素诱导日本鳗鲡卵巢发育效果的评价方法，其特征在于，所述非变性哺乳动物蛋白抽提液用NaOH调节pH值至8.0。4.根据权利要求1所述的一种激素诱导日本鳗鲡卵巢发育效果的评价方法，其特征在于，所述获取卵黄蛋白原的方法，其具体操作如下：S21对所述雌性日本鳗鲡注射所述雌二醇；S22抽取所述日本鳗鲡的血液，经静置离心后，吸取含有卵黄蛋白原的血清。5.根据权利要求4所述的一种激素诱导日本鳗鲡卵巢...

【专利技术属性】
技术研发人员：齐鑫，左陈鹏，李昀，温海深，王孝杰，吕里康，闫少静，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：