一种基于中性氨基酸转运蛋白在外泌体中的表达在衰老检测中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种基于中性氨基酸转运蛋白在外泌体中的表达在衰老检测中的应用，涉及生物衰老检测领域，包括从机体的体液中获得一定浓度的外泌体，利用免疫学检测方法对外泌体中的SLC1A5基因编码表达翻译后产生的中性氨基酸转运蛋白进行测定。本发明专利技术利用对衰老过程中外泌体内表达量升高的如基因SLC1A5的蛋白质产物等的定量检测，应用于对于机体细胞衰老状态的确定，并可用于对抗衰老干预的有效性的检测，相对于目前已有的衰老测定方法，具有取样简便，检测流程相对快，重复性好，可靠性高等优点。优点。

【技术实现步骤摘要】
一种基于中性氨基酸转运蛋白在外泌体中的表达在衰老检测中的应用


[0001]本专利技术涉及生物衰老检测领域，特别涉及一种基于抽取获得的外泌体测定细胞衰老程度的方法。

技术介绍

[0002]衰老是一种生物体随生命时间增长而机能衰退的生理过程，与所有类型疾病的发生率和死亡率都密切相关。因此人们对衰老的研究展开了大量的研究，并希望开发出干预衰老过程的技术。不论是研究衰老的生物学机制，还是研发干预衰老的技术手段，都需一种检测机体衰老的速度和程度的方法作为技术基础。目前对衰老程度的检测主要仍围绕自然年龄或人体机能测试等外在的检测手段。然而，由于遗传和生活习惯等因素，不同个体之间的衰老速度存在差异，通过上述常规的外在检测手段不能客观的反映真正的衰老程度。
[0003]近年来，分子生物学和生物化学手段被逐渐应用于衰老程度的检测。但是，这些内在的检测方法仍存在一些问题。例如，血液中的IL
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6、TNF
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a、C
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reactive protein(CRP)可以用于检测衰老的程度，但是样本离开机体后很容易降解而造成数据不准确，因此不能很好反映真实衰老程度。此外，DNA损伤、端粒长度以及DNA甲基化也被应用到衰老程度的检测，但是由于这些方法实施起来较为复杂，取样也相对不便。因此，需要研发新的简单易行、可靠性高的内在检测手段。
[0004]外泌体是一种由细胞分泌的直径在40
‑
160nm之间的有膜小泡，其中包含脂类、蛋白质、核酸等生物活性分子，在介导细胞间的通讯过程中发挥了重要作用。由于外泌体可以保护内容物不被降解以及其抽取的来源和方法比较便捷等优势，在疾病诊断方面，外泌体已经被尝试用于肿瘤等疾病的早期诊断或预后。这提示我们，外泌体也存在用于检测衰老过程的潜力。
[0005]SLC1A5(Solute Carrier Family 1Member 5)基因编码产生三种位于细胞膜中的中性氨基酸转运蛋白，即neutral amino acid transporter B(0)isoform 1、neutral amino acid transporter B(0) isoform 2和neutral amino acid transporter B(0)isoform 3，这些蛋白在很多类型的正常组织中广泛表达。而在细胞衰老的模型中，SLC1A5的蛋白产物的表达量显著上升，具有良好的特异性和重复性。更为引人注意的是，SLC1A5的蛋白产物也可以在多种来源的外泌体中被检测到。

技术实现思路

[0006]本专利技术要解决的技术问题是提供一种基于中性氨基酸转运蛋白在外泌体中的表达在衰老检测中的应用，解决现有的衰老检测实施较为不便且检测结构不准确的问题。
[0007]为了解决上述技术问题，本专利技术的技术方案为：
[0008]一种基于中性氨基酸转运蛋白在外泌体中的表达在衰老检测中的应用，从机体的体液中获得一定浓度的外泌体，利用免疫学检测方法对外泌体中的SLC1A5基因编码表达翻
译后产生的中性氨基酸转运蛋白进行测定。
[0009]优选的，所述外泌体是从机体的体液中抽取获得。
[0010]优选的，所述体液为血液、脑脊液、泪液、唾液、痰液、心包液、胸腔、腹腔液、胃液、胰液、胆液、前列腺液、关节腔液、淋巴液、尿液、精液、阴道分泌液、羊水或汗液中的至少一种。
[0011]优选的，从机体的体液中获得一定浓度的外泌体的方法采用超离心分离法、密度梯度离心分离法、过滤法、免疫亲和分离法、沉淀法、微流体分离法或尺寸排除色谱法中的至少一种。
[0012]优选的，所述外泌体直径范围为40
‑
160nm。
[0013]优选的，所述免疫学检测方法包括荧光免疫技术、放射免疫技术、酶联免疫技术、化学发光免疫技术或免疫金标记技术中的至少一种。
[0014]优选的，对中性氨基酸转运蛋白进行定量或半定量测定。
[0015]采用上述技术方案，本专利技术利用对衰老过程中外泌体内表达量升高的如基因SLC1A5的蛋白质产物等的定量检测，应用于对于机体细胞衰老状态的确定，并可用于对抗衰老干预的有效性的检测，相对于目前已有的衰老测定方法，具有取样简便，检测流程相对快，重复性好，可靠性高等优点。
具体实施方式
[0016]下面对本专利技术的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本专利技术，但并不构成对本专利技术的限定。此外，下面所描述的本专利技术各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
[0017]实施例1
[0018]建立衰老细胞模型；抽提外泌体。具体方案如下：
[0019](1
‑
1)向人胚肾HEK293细胞系的培养基中添加阿霉素，处理24小时后，使用SA
‑
β半乳糖苷酶试剂盒确定上述处理后的细胞模型的衰老状态；
[0020](1
‑
2)待细胞融合度达到90％左右时，收集细胞上清液装入无菌50ml离心管中，封口膜密封，然后离心，弃细胞沉淀，收集上清液至新的无菌50ml离心管中，无菌封装，
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80℃保存；
[0021](1
‑
3)超速离心提取外泌体：低速离心10min，中速离心10min，高速离心30min，收集上清液，弃沉淀，然后用超速离心机进行两次超速离心，第一次超速离心70min，丢弃上清保留沉淀用大量PBS洗涤；然后进行第二次超速离心70min，第二次离心结束后获得的沉淀即为外泌体沉淀物，以上离心步骤均在4℃进行；
[0022](1
‑
4)使用PBS溶解沉淀，50μl每管分装，
‑
80℃保存。
[0023]实施例2
[0024]从年长志愿者的血液中抽提外泌体，具体方案如下：
[0025](2
‑
1)从年长志愿者静脉中抽取50mL外周血，然后低速离心10min，弃细胞沉淀，收集上清液至新的无菌50ml离心管中，无菌封装，
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80℃保存，
[0026](2
‑
2)试剂盒法提取胞外囊泡：
[0027](2
‑2‑
1)收集新鲜上清液或从
‑
80℃保存的上清液在4℃溶解，保持在4℃，中速离
心15min除去细胞碎片，将上清液转移至新50ml离心管中；
[0028](2
‑2‑
2)加入等体积的Buffer XBP，轻轻颠倒离心管5次，使其混合，置于试管架上升至室温；
[0029](2
‑2‑
3)在exoEasy离心柱膜上加样品Buffer XBP混合液10mL，低速离心1分钟，丢弃流出物，将离心柱膜放入同一离心管中，若样品
‑
Buffer XBP混合液体积大于10mL，重复此步骤，待所有液体均通过离心柱本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于中性氨基酸转运蛋白在外泌体中的表达在衰老检测中的应用，其特征在于：从机体的体液中获得一定浓度的外泌体，利用免疫学检测方法对外泌体中的SLC1A5基因编码表达翻译后产生的中性氨基酸转运蛋白进行测定。2.根据权利要求1所述的基于中性氨基酸转运蛋白在外泌体中的表达在衰老检测中的应用，其特征在于：所述外泌体是从机体的体液中抽取获得。3.根据权利要求1所述的基于中性氨基酸转运蛋白在外泌体中的表达在衰老检测中的应用，其特征在于：所述体液为血液、脑脊液、泪液、唾液、痰液、心包液、胸腔、腹腔液、胃液、胰液、胆液、前列腺液、关节腔液、淋巴液、尿液、精液、阴道分泌液、羊水或汗液中的至少一种。4.根据权利要求1所述的基于中性氨基酸转运蛋白在外泌体中的表达在衰老检测中的应用，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：王菲，陈坤，宫岩，姜辉，
申请(专利权)人：山东赛珥医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：