用于调节腺相关病毒(AAV)和AAV受体(AAVR)之间的相互作用以改变AAV生物分布的方法和组合物技术

本公开描述了用于改变腺相关病毒(AAV)在受试者中的生物分布的组合物和方法。受试者中的生物分布的组合物和方法。受试者中的生物分布的组合物和方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于调节腺相关病毒(AAV)和AAV受体(AAVR)之间的相互作用以改变AAV生物分布的方法和组合物
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2019年9月9日提交的美国临时专利申请第62/897,973号和2019年11月13日提交的美国临时专利申请第62/934,996号的权益，每个专利申请的全部内容通过引用并入本专利技术。


[0003]本公开总体上涉及病毒，特别是腺相关病毒(AAV)。
[0004]援引并入
[0005]本申请包含已通过EFS
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Web提交的附录，并在此通过引用而整体并入。该PDF文件创建于2020年9月9日，命名为Sequence Annex.pdf，大小为65.9千字节。
[0006]专利技术背景
[0007]腺相关病毒(AAV)在呈现复制缺陷时可用作治疗性基因转移的载体系统。AAV由称为衣壳且包封单链DNA的蛋白质壳组成。实现包封的DNA分子的最低要求是DNA必须是单链的，并且必须包括AAV的侧翼反向末端重复(ITR)。衣壳结构是大型的多蛋白组装体，其形成由三个60种蛋白质单体组成的呈二十面体组装体形式的具有20个面的球状颗粒。这些单体形成衣壳蛋白。存在具有重叠序列的三种衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。VP3是最短的蛋白质，构成了初级颗粒结构，即形成二十面体组件的基本构件。VP2是较长的蛋白质，在其C端完全包含VP3并在N端延伸。类似地，VP1在其C端包含VP2和VP3。尽管在结构上不需要VP1和VP2以形成衣壳，但两者都是AAV感染性所必需的。
[0008]一般来说，衣壳被认为是传染性和宿主载体相关特性的主要决定因素，宿主载体相关特性例如为适应性免疫应答、趋向性、特异性、效力和生物分布。事实上，已知这些特性中的一些在天然和工程化AAV血清型和变体之间有所不同。然而，迄今为止，对于衣壳上的这些变化如何在功能上改变这些特性尚无机制理解，因此，没有合理的基础来工程改造AAV以控制这些特性的任何水平。例如，多种治疗方法通过全身注射使用AAV以靶向全身肌肉组织从而治疗例如杜氏肌营养不良症(DMD)的神经肌肉疾病。然而，目前用于这些方法的如AAV9和rh74的载体都需要高剂量以确保肌肉靶向，并且载体天然以肝为主要靶标。然而，肝组织不参与DMD疾病的病理学。
[0009]2016年，Jan Carette的研究小组将称为AAVR(也称为KIAA0319L)的蛋白质鉴定为许多AAV的重要进入因子或受体(Pillay等人，2016，Nature，530(7588)：108
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12)。2019年，两个独立小组报告了与AAVR受体(本文称为AAVR足迹)交界的AAV颗粒部分的结构分辨率(Meyer等人，2019，Elife，8pii：e44707；Zhang等人,2019,Nat.Microbiol.,4(4):675
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682)。
[0010]专利技术概述
[0011]本公开至少部分基于以下发现：可以操纵、干扰或破坏各种AAV与AAVR足迹内特定位置处的某些特定氨基酸的结合，以改变AAV在受试者中的生物分布。例如通过调节如降低
或增加AAV对肝细胞的转导，而不完全抑制AAV与肝细胞的结合或AAV转导受试者的肝或其他细胞的能力。
[0012]在一方面，本公开提供了调节腺相关病毒(AAV)至受试者内的肝细胞的生物分布的方法。此类方法包括在AAV中提供未修饰的AAV衣壳蛋白；并将AAV中衣壳蛋白中以下一个或多个位置处的至少一个氨基酸残基替换为不同的氨基酸：Q263、S264、G265、A266、S267、N268、H271、N382、G383、S384、Q385、S446、R471、W502、T503、D528、D529、Q589、K706或V708(相对于AAV2衣壳序列(SEQ ID NO:1)编号)，从而以足以改变但不完全抑制AAV转导肝细胞的能力的方式修饰AAV衣壳蛋白与肝细胞上的AAV受体(AAVR)之间的结合。
[0013]在一些情况下，AAV至肝细胞或在肝细胞中的生物分布增加。在其他情况下，AAV至肝细胞或在肝细胞中的生物分布减少。
[0014]在一些实施方案中，至少一个氨基酸残基的替换包括编码AAV衣壳蛋白的核酸的诱变。在一些情况下，替换步骤导致保守氨基酸的取代。
[0015]在另一方面，本公开提供了调节腺相关病毒(AAV)至受试者内的肝细胞的生物分布的方法。此类方法包括在AAV中提供未修饰的AAV衣壳蛋白；并用不同的氨基酸替换AAV衣壳蛋白中位置S446、R471或V708(相对于AAV2衣壳序列(SEQ ID NO:1)编号)的一个或多个处的至少一个氨基酸残基，从而以足以改变但不完全抑制AAV转导肝细胞的能力的方式修饰AAV衣壳蛋白与肝细胞上的AAV受体(AAVR)之间的结合。
[0016]在一些情况下，AAV转导肝细胞的能力增加，而在一些情况下，AAV转导肝细胞的能力降低。
[0017]在一些实施方案中，替换的氨基酸残基是S446N、S446R、R471A、R471S、V708T或V708A(相对于AAV2衣壳序列(SEQ ID NO:1)编号)中的任意一个或多个。在一些实施方案中，至少一个氨基酸残基的替换包括编码AAV衣壳蛋白的核酸的诱变。
[0018]在又一方面，本公开提供了非天然存在的AAV衣壳蛋白，其包括具有在选自位置446、471或708(相对于AAV2衣壳序列(SEQ ID NO:1)编号)的位置处的至少一个氨基酸残基不同于野生型、未修饰的AAV衣壳蛋白氨基酸序列的氨基酸序列，其中非天然存在的AAV衣壳蛋白氨基酸序列与野生型AAV序列相比，以足以改变但不完全抑制AAV转导肝细胞的能力的方式提供改变的AAV衣壳蛋白与肝细胞的结合。
[0019]在一些实施方案中，非天然存在的氨基酸序列包含S446N、S446R、R471A、R471S、V708T或V708A(相对于AAV2衣壳序列(SEQ ID NO:1)编号)中的至少一个。
[0020]在一些情况下，非天然存在的AAV衣壳蛋白与肝的结合增加，例如当AAV衣壳包括在位置446处的R、在位置471处的A或在位置708处的T(相对于AAV2(SEQ ID NO:1)编号)的情况下。在一些情况下，非天然存在的AAV衣壳蛋白与肝的结合降低，例如当AAV衣壳包括在位置446处的S、在位置471处的S或在位置708处的A(相对于AAV2(SEQ ID NO:1)编号)的情况下。
[0021]在又一方面，本公开提供了改变受试者中AAV的肝靶向的方法。此类方法包括向受试者施用包括如本文所述的非天然存在的AAV衣壳蛋白的AAV。在一些实施方案中，施用是静脉内施用。在一些实施方案中，施用重复多次。
[0022]在一方面，本公开的特征在于改变腺相关病毒(AAV)在受试者中的生物分布的方法，该方法包括通过破坏或干扰AAV与肝细胞上的AAV受体(AAVR)的结合来调节AA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.包含非天然存在的修饰的AAV VP1衣壳蛋白的病毒，其包含当使用具有默认算法参数的基本局部比对搜索工具(BLAST)程序比对所述修饰的AAV衣壳蛋白的氨基酸序列和未修饰的AAV VP1衣壳蛋白的氨基酸序列时，与所述未修饰的AAV VP1衣壳蛋白的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；其中所述修饰的VP1衣壳蛋白的氨基酸序列与所述未修饰的VP1衣壳蛋白的氨基酸序列在至少一个选自下组氨基酸位置的氨基酸位置处不同：Q263、S264、G265、A266、S267、N268、H271、N382、G383、S384、Q385、S446、R471、W502、T503、D528、D529、Q589、K706和V708，当使用所述具有默认算法参数的基本局部比对搜索工具(BLAST)程序比对SEQ ID NO:1和所述未修饰的AAV衣壳蛋白的氨基酸序列时，这些氨基酸位置相对于AAV2 VP1衣壳蛋白(SEQ ID NO:1)进行编号。2.权利要求1的病毒，其中所述修饰的VP1衣壳蛋白的氨基酸序列包含至少一个选自446R、471A和708T的氨基酸残基。3.权利要求1的病毒，其中所述修饰的VP1衣壳蛋白的氨基酸序列包含至少两个选自446R、471A和708T的氨基酸残基。4.权利要求1的病毒，其中所述修饰的VP1衣壳蛋白的氨基酸序列包含氨基酸残基446R、471A和708T。5.权利要求1的病毒，其中所述修饰的VP1衣壳蛋白的氨基酸序列包含至少一个选自446S、471S和708A的氨基酸残基。6.权利要求1的病毒，其中所述修饰的VP1衣壳蛋白的氨基酸序列包含至少两个选自446S、471S和708A的氨基酸残基。7.权利要求1的病毒，其中所述修饰的VP1衣壳蛋白的氨基酸序列包含446S、471S和708A。8.权利要求1至7中任一项的病毒，其中所述修饰的VP1衣壳蛋白的氨基酸序列与所述未修饰的VP1衣壳蛋白的氨基酸序列仅在以下氨基酸位置的一个或多个处不同：Q263、S264、G265、A266、S267、N268、H271、N382、G383、S384、Q385、S446、R471、W502、T503、D528、D529、Q589、K706和V708，并且不在所述未修饰的VP1衣壳蛋白的其他氨基酸位置处不同。9.权利要求1至8中任一项的病毒，其中所述未修饰的VP1衣壳蛋白选自来自以下的VP1衣壳蛋白：AAV1、AAV2、AAV3、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、rh.10、hu.37、LK
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03、AAV5、AAV10、Hu68；Anc80；Anc81；Anc82；Anc83；Anc84；Anc94；Anc113；Anc126；Anc127；Anc80L27；Anc80L59；Anc80L60；Anc80L62；Anc80L65；Anc80L33；Anc80L36；Anc80L44；Anc80L1；Anc110；Anc80DI；AAV1 vp1；AAV2 vp1；AAV9vp1；Anc80；Anc126；Anc127；AAV3；AAV7；AAV8；rh10；hu37；和hu.68。10.权利要求1至9中任一项的病毒，其中当使用具有默认算法参数的基本局部比对搜索工具(BLAST)程序比对所述修饰的AAV衣壳蛋白的氨基酸序列和所述未修饰的AAV VP1衣壳蛋白的氨基酸序列时，所述非天然存在的修饰的AAV VP1衣壳蛋白包含与所述未修饰的AAV VP1衣壳蛋白的氨基酸序列具有至少96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。11.修饰的可组装的重组AAV(rAAV)，其包含：VP1、VP2和VP3衣壳蛋白，以及
重组核酸载体，其中所述VPl衣壳蛋白是权利要求1至10中任一项的修饰的VPl衣壳蛋白。12.修饰的可组装的重组AAV(rAAV)，其包含：VP1、VP2和VP3衣壳蛋白；以及重组核酸载体，其中当使用具有默认算法参数的基本局部比对搜索工具(BLAST)程序比对修饰的AAV VP1衣壳蛋白的氨基酸序列与未修饰的AAV VP1衣壳蛋白的氨基酸序列时，至少所述VP1衣壳蛋白是包含与所述未修饰的AAV VP1衣壳蛋白的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性的氨基酸序列的非天然存在的修饰的VP1衣壳蛋白，并且其中所述修饰的VP1衣壳蛋白与所述未修饰的VP1衣壳蛋白的不同之处在于，相较于具有所述未修饰的VP1衣壳蛋白的未修饰的rAAV施用于与第一哺乳动物受试者相同类型的第二哺乳动物受试者后的所述未修饰的rAAV的生物分布，所述修饰的VP1衣壳蛋白包含所述修饰的rAAV施用于所述第一哺乳动物受试者后改变所述修饰的rAAV的生物分布的手段，其中所述未修饰的rAAV包含具有除所述手段外与所述修饰的rAAV的氨基酸序列相同的氨基酸序列的VP1、VP2和VP3衣壳蛋白。13.权利要求11或权利要求12的修饰的rAAV，其中相较于包含所述未修饰的VP1衣壳蛋白的所述未修饰的rAAV施用于与第一哺乳动物受试者相同类型的第二哺乳动物受试者后的肝细胞转导，所述修饰的rAAV在施用于所述第一哺乳动物受试者后实现了更高的肝细胞转导。14.权利要求11至13中任一项的修饰的rAAV，其中相较于包含所述未修饰的VP1衣壳蛋白的未修饰的rAAV施用于与第一哺乳动物受试者相同类型的第二哺乳动物受试者后的可表达多肽在肝细胞中的表达，所述修饰的rAAV在施用于所述第一哺乳动物受试者后表现出更高的由所述重组核酸载体编码的所述可表达多肽在肝细胞中的表达。15.权利要求11或权利要求12的修饰的rAAV，其中相较于包含所述未修饰的VP1衣壳蛋白的未修饰的rAAV施用于与第一哺乳动物受试者相同类型的第二哺乳动物受试者后的肝细胞转导，所述修饰的rAAV在施用于所述第一哺乳动物受试者后实现了更低的肝细胞转导。16.权利要求11、12或15中任一项的修饰的rAAV，其中相较于包含所述未修饰的VP1衣壳蛋白的未修饰的rAAV施用于与第一哺乳动物受试者相同类型的第二哺乳动物受试者后的可表达多肽在肝细胞中的表达，所述修饰的rAAV在施用于所述第一哺乳动物受试者后表现出更低的由所述重组核酸载体编码的所述可表达多肽在肝细胞中的表达。17.权利要求11至16中任一项的修饰的rAAV，其中相较于包含所述未修饰的VP1衣壳蛋白的未修饰的rAAV与所述第二哺乳动物受试者的肝细胞上表达的AAV受体(AAVR)的相互作用，所述修饰的rAAV具有改变的与所述第一哺乳动物受试者的肝细胞上表达的AAVR的相互作用。18.权利要求17的修饰的rAAV，其中相较于包含所述未修饰的VP1衣壳蛋白的未修饰的rAAV与所述第二哺乳动物受试者的肝细胞上表达的AAV受体(AAVR)的相互作用，所述修饰的rAAV具有增加的与所述第一哺乳动物受试者的肝细胞上表达的AAVR的相互作用。19.权利要求17的修饰的rAAV，其中相较于包含所述未修饰的VP1衣壳蛋白的未修饰的
rAAV与所述第二哺乳动物受试者的肝细胞上表达的AAV受体(AAVR)的相互作用，所述修饰的rAAV具有降低的与所述第一哺乳动物受试者的肝细胞上表达的AAVR的相互作用。20.权利要求11至19中任一项的修饰的rAAV，其中所述第一哺乳动物受试者和所述第二哺乳动物受试者是人或非人灵长类动物(NHP)。21.权利要求11至20中任一项的修饰的rAAV，其中所述施用包含全身施用，例如静脉内输注。22.权利要求11至21中任一项的修饰的rAAV，其中相较于通过相同施用途径以相同量施用的包含所述未修饰的VP1衣壳蛋白的未修饰的rAAV，所述修饰的rAAV在施用于哺乳动物受试者例如人受试者时具有更低的肝毒性。23.权利要求11至22中任一项的修饰的rAAV，其中所述修饰的rAAV施用于所述第一哺乳动物受试者后改变所述修饰的rAAV的生物分布的手段包括在选自下组的位置处的一个或多个氨基酸残基处的突变：Q263、S264、...

【专利技术属性】
技术研发人员：E津恩，C蒂珀，LH范登贝格，
申请(专利权)人：司科彭斯眼部研究学会，
类型：发明
国别省市：