一种尿路上皮细胞的诱导剂和尿路上皮细胞的诱导方法技术

本发明专利技术的目的在于提供一种尿路上皮细胞的制备方法，其能够应用于治疗泌尿系统疾病，尤其是尿路上皮细胞损伤引起的疾病或尿路上皮细胞缺失或功能障碍引起的疾病，以及提供通过方法所制备的尿路上皮细胞和用于诱导(制备)尿路上皮细胞的培养基。由诱导尿路上皮细胞的方法制备的尿路上皮细胞能够应用于治疗泌尿系统疾病，该方法包括通过向哺乳动物的体细胞导入以下外源因子中至少一种的步骤，FOXA1(叉头盒蛋白A1，Forkhead box A1)基因或其表达产物、TP63(肿瘤蛋白P63，tumor protein P63)基因或其表达产物、MYCL(L

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】一种尿路上皮细胞的诱导剂和尿路上皮细胞的诱导方法


[0001]本专利技术主要涉及一种尿路上皮细胞的诱导方法，具体涉及一种通过基因直接重组(Direct reprogramming)诱导尿路上皮细胞的方法，以及用于由体细胞转化为尿路上皮细胞的制剂。

技术介绍

[0002]在由肾盂、输尿管、膀胱和近端尿道组成的尿路表面，尿路上皮细胞构成尿路上皮。尿路上皮根据尿液的储存量收缩或扩张，并且成为对尿液渗出或细菌入侵的强大的屏障。如膀胱癌、膀胱过度活动症(Overactive Bladder)、先天性膀胱异常、膀胱损伤、间质性膀胱炎、神经源性膀胱、萎缩性膀胱等尿路疾病与尿路上皮细胞的缺失和/或功能障碍有关。尿路上皮受损的患者通过移植自身的一段肠道或大肠组织进行治疗(例如，剥离肠道上皮并将其移植为膀胱上皮的外科技术)，但是，这些消化组织简单地重吸收尿液，并导致包括致癌、代谢性酸中毒、感染和结石等在内的许多问题。
[0003]另外，作为一种间质性膀胱炎的Hunner型间质性膀胱炎的现行治疗方法，实施向膀胱内注射DMSO或利多卡因(Xylocaine)的方法和强行扩张膀胱(膀胱扩张术)的方法。但是，虽然短期有效，但不具有长期效果，目前没有根治方法。
[0004]鉴于这些问题，已经做出了很多努力来寻找适于移植的细胞的其他来源，来替代消化道(alimentary tract)组织片段。已经报道有使用胶原
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聚乙醇酸(collagen
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Polyglycolic acid)支架的培养来进行扩张膀胱组织的自体移植。虽然这种方法在移植后的短期内取得了足够的效果，但经过长期追踪观察，自体膀胱组织存在功能障碍的可能，因此未能广泛应用。已经报道有从非尿路上皮的未成熟干细胞诱导尿路上皮的方法。已经报道有将来自人胎儿骨髓的间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)与患者的尿路上皮细胞共培养的方法(非专利文献1)或通过添加尿路上皮细胞的培养上清液来培养来自人脂肪的干细胞的方法(非专利文献2)。但是，这种方法需要自体尿路上皮细胞，因此这些细胞几乎没有用于临床。另外，已经报道有由人ES细胞和诱导性多能干细胞(iPS细胞)制备尿路上皮细胞的方法(非专利文献3、4)，但来自人多能干细胞的细胞移植可能导致形成畸胎瘤(teratoma)。
[0005]另一方面，诱导由其他体细胞系分化的组织细胞的直接转换(Direct conversion)(基因直接重组(Direct reprogramming))而不经过多能性状态的技术是已知的。本申请专利技术人此前已确定报道了由体细胞(例如，成纤维细胞)基因直接重组至成骨细胞(专利文献1、非专利文献5)、棕色脂肪细胞(专利文献2、非专利文献6)、施万细胞(schwann cell)(专利文献3、非专利文献7)和成肌细胞(myoblast)(专利文献4、非专利文献8)的技术，但是，没有报道由体细胞转化为尿路上皮细胞的事例。
[0006]现有技术文献
[0007]专利文献
[0008]专利文献1：WO2015/012377
[0009]专利文献2：WO2014/010746
[0010]专利文献3：WO2016/039462
[0011]专利文献4：WO2018/124292
[0012]非专利文献
[0013]非专利文献1：Ning J,et al.,(2011)Cytotechnology 63(5):531
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539.
[0014]非专利文献2：Shi JG,et al.,(2012)Cell Tissue Res 347(3):737
‑
746.
[0015]非专利文献3：Osborn SL,et al.,(2014)Stem Cell Transl Med 3(5):610
‑
619.
[0016]非专利文献4：Kang M,et al.,(2014)Int J Mol Sci 15(5):7139
‑
7157。
[0017]非专利文献5：Yamamoto K,et al.,(2015)Proc Natl Acad Sci USA 112(19):6152
‑
6157。
[0018]非专利文献6：Kishida T,et al.,(2015)Stem Cell Reports 5(4):569
‑
581。
[0019]非专利文献7：Sowa Y,et al.,(2017)Stem Cells Transl Med 6(4):1207
‑
1216。
[0020]非专利文献8：Wakao J,et al.,(2017)Biochem Biophys Res Commun488(2):368
‑
373.

技术实现思路

[0021]专利技术解决的技术问题
[0022]本专利技术的目的在于提供一种制备尿路上皮细胞的方法，该方法能够应用于治疗泌尿系统疾病，尤其是尿路上皮细胞损伤引起的疾病或尿路上皮细胞缺失或功能障碍引起的疾病等，并提供了一种通过该方法制备的尿路上皮细胞和适于该方法的用于诱导尿路上皮细胞的培养基。
[0023]解决技术问题的技术手段
[0024]鉴于上述技术问题，本申请专利技术人基于此前的知识进行了深入研究。具体地，尝试通过基因直接重组技术由体细胞制备尿路上皮细胞而不经过多能性状态。基因直接重组可以通过转导(transduction)编码在靶细胞分化阶段起重要作用的转录因子(transcription factor)的基因或促进体细胞初始化的基因来实现。本申请专利技术人发现，通过导入若干基因，能够将人成纤维细胞直接转化为尿路上皮细胞，并确定了转化步骤，而且分析了所得到的直接转化的尿路上皮细胞(dUC)的表型和功能，从而完成了本专利技术。
[0025]即，本专利技术如下所示。
[0026][1]一种诱导尿路上皮细胞的方法，包括：
[0027]向哺乳动物的体细胞内导入以下外源因子中的至少一种的步骤，
[0028]FOXA1(叉头盒蛋白A1，Forkhead box A1)基因或其表达产物、
[0029]TP63(肿瘤蛋白P63，tumor protein P63)基因或其表达产物、
[0030]MYCL(L
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Myc)基因或其表达产物、和
[0031]KLF4(Kruppel样因子4，Kruppel
‑
like factor 4)基因或其表达产物。
[0032][2]根据上述[1]所述的方法，其中，外源因子包括FOXA1基因或其表达产物和TP63基因或其表达产物。
[0033][3]根据上述[1]所述的方法，其中，所述外源因子选自：
[0034](i)KLF4基因或其表达产物
[0035本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种诱导尿路上皮细胞的方法，包括：向哺乳动物的体细胞内导入以下外源因子中的至少一种的步骤，FOXA1(Forkhead box A1)基因或其表达产物；TP63(tumor protein P63)基因或其表达产物；MYCL(L
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Myc)基因或其表达产物；和KLF4(Kruppel
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like factor 4)基因或其表达产物。2.根据权利要求1所述的方法，其中，外源因子包括FOXA1基因或其表达产物和TP63基因或其表达产物。3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述外源因子选自：(i)KLF4基因或其表达产物；(ii)TP63基因或其表达产物和KLF4基因或其表达产物；(iii)MYCL基因或其表达产物和KLF4基因或其表达产物；(iv)FOXA1基因或其表达产物、MYCL基因或其表达产物和KLF4基因或其表达产物；(v)TP63基因或其表达产物、MYCL基因或其表达产物和KLF4基因或其表达产物；(vi)FOXA1基因或其表达产物、TP63基因或其表达产物和KLF4基因或其表达产物；(vii)FOXA1基因或其表达产物、TP63基因或其表达产物、MYCL基因或其表达产物和KLF4基因或其表达产物。4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，所述体细胞为人成纤维细胞。5.一种尿路上皮细胞，来自哺乳动物的体细胞，具有以下外源因子中的至少一种，FOXA1基因或其表达产物；TP63基因或其表达产物；MYCL基因或其表达产物；和KLF4基因或其表达产物。6.根据权利要求5所述的细胞，其中，所述外源因子包括FOXA1基因或其表达产物和TP63基因或其表达产物。7.根据权利要求5所述的细胞，其中，所述外源因子选自：(i)KLF4基因或其表达产物；(ii)TP63基因或其表达产物和KLF4基因或其表达产物；(iii)MYCL基因或其表达产物和KLF4基因或其表达产物；(iv)FOXA1基因或其表达产物、MYCL基因或其表达产物和KLF4基因或其表达产物；(v)TP63基因或其表达产物、MYCL基因或其表达产物和KLF4基因或其表达产物；(vi)FOXA1基因或其表达产物、TP63基因或其表达产物和KLF4基因或其表达产物；(vii)FOXA1基因或其表达产物、TP63基因或其表达产物、MYCL基因或其表达产物和KLF4基因或其表达产物。8.根据权利要求5～7中任一项所述的细胞，其中，所述体细胞是人成纤维细胞。9.一种用于将哺乳动物的体细胞转化为尿路上皮细胞的制剂，包含以下外源因子中的至少一种，FOXA1基因或其表达产物；TP63基因或其表达产物；
MYCL基因或其表达产物；和KLF4基因或其表达产物。10.根据权利要求9所述的制剂，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：井上裕太，松田修，岸田纲郎，浮村理，关诚，
申请(专利权)人：细流而希佳股份有限公司，
类型：发明
国别省市：