一种鹿茸生茸区骨膜的冷冻保存方法技术

本发明专利技术公开了一种鹿茸生茸区骨膜的冷冻保存方法，涉及鹿茸生茸区骨膜保存技术领域；该冷冻保存方法先将待冷冻的鹿茸生茸区骨膜经平衡液进行平衡，其后放入玻璃化冷冻保存液A中进行处理，使玻璃化冷冻保存液A中的海藻糖在甘油和超声波的作用下充分渗透入鹿茸生茸区骨膜中的细胞内，其后将鹿茸生茸区骨膜放于玻璃化冷冻保存液B中进行玻璃化冷冻降温，降温后在液氮下进行长时间保存。该方法通过将难以渗透进细胞膜内的海藻糖先渗透进细胞膜内，提高胞内的渗透压，避免细胞在冷冻过程中因胞内外渗透压相差过大，导致细胞大量脱水而皱缩失活；通过用对细胞无毒的海藻糖替换对细胞有毒害的DMSO，降低细胞的死亡率，增强鹿茸生茸区骨膜在复苏后的活性。区骨膜在复苏后的活性。

【技术实现步骤摘要】
一种鹿茸生茸区骨膜的冷冻保存方法


[0001]本专利技术涉及鹿茸生茸区骨膜的保存
，特别是一种鹿茸生茸区骨膜的冷冻保存方法。

技术介绍

[0002]鹿是我国传统的名贵药用动物，在现存文献中，汉代文献就有“鹿身百宝”的说法，是灵丹妙药的象征，有极高的药用价值和保健功效，能够预防和治疗多种疾病。而鹿的初生幼角——鹿茸更是被视作“宝中之宝”。
[0003]鹿茸是指梅花鹿或马鹿的雄鹿未骨化而带茸毛的幼角，乃名贵中药材，在雄鹿头部额骨外侧角柄及鹿茸发生的部位称为生茸区，仔鹿到第二年春天，生茸区的骨质逐步发生隆起，形成突脊，称为额外脊，呈前后长内外窄的椭圆形，中间突起形成脊状，额外脊上附着的骨膜称为生茸区骨膜，生茸区骨膜具有巨大的生茸潜力，将生茸区骨膜移植到鹿体的其它部位,能诱导异位鹿茸的发生；一片直径约2cm的生茸区骨膜组能够在约60d内再生出约10kg左右的鹿茸组织。
[0004]现有技术中，鹿茸再生原因为生茸区骨膜中的干细胞。为了进一步研究鹿茸生物学和揭示鹿茸再生机制，需要对鹿茸生茸区骨膜进行持续性的实验，因此需对收集的鹿茸生茸区骨膜进行保存，以实现随时取用的目的。现有技术中，常采用冷冻保存的方式进行，即将鹿茸生茸区骨膜经特定的保护处理和降温操作后置于
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196℃的液氮中，使鹿茸生茸区骨膜中的干细胞生长暂时停滞并保持其细胞特性，在使用时进行解冻复苏。
[0005]现有技术中，为了增加冷冻速度，常采用玻璃化冷冻方法对鹿茸生茸区骨膜进行冻存，具体做法是将鹿茸生茸区骨膜置于玻璃化冷冻保存液中平衡后，直接置于液氮环境中使鹿茸生茸区骨膜中的干细胞内外的水分子迅速进入玻璃化状态。为了实现玻璃化冷冻的目的，常在玻璃化冷冻液中添加大量(10
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15wt％)二甲基亚砜(DMSO)以作为玻璃化试剂结合体系中的水分，而大量的DMSO具有细胞毒性和表观遗传毒性，影响干细胞的存活率与功能，导致鹿茸生茸区骨膜复苏后的临床效果不理想，难以顺利发挥鹿茸再生的功效。

技术实现思路

[0006]针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种鹿茸生茸区骨膜的冷冻保存方法，先将待冷冻的鹿茸生茸区骨膜经平衡液进行平衡，其后放入玻璃化冷冻保存液A中结合超声波进行处理，使玻璃化冷冻保存液A中的海藻糖在甘油和超声波的作用下充分渗透入鹿茸生茸区骨膜中的细胞内，其后将鹿茸生茸区骨膜放于玻璃化冷冻保存液B中进行玻璃化冷冻降温，降温后在液氮下进行长时间保存。该方法通过将难以渗透进细胞膜内的海藻糖先渗透进细胞膜内，提高胞内的渗透压，使在冷冻过程中能够保持渗透压平衡，进而避免细胞膜在冷冻过程中因胞内外渗透压相差过大，导致细胞大量脱水而皱缩，其至死亡；整个方法中用对细胞无毒的海藻糖替换对细胞有毒害的DMSO，降低细胞的死亡率，增强鹿茸生茸区骨膜在复苏后的活性。
[0007]本专利技术是通过以下技术方案来实现的：
[0008]一种鹿茸生茸区骨膜的冷冻保存方法，包括如下步骤：
[0009]S1将待冻存的鹿茸生茸区骨膜放入平衡液中平衡5
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7min；
[0010]S2将步骤S1中经平衡后的鹿茸生茸区骨膜放入玻璃化冷冻保存液A中，其后经超声波处理3
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5min；
[0011]S3将步骤S2中经超声波处理后的鹿茸生茸区骨膜放入玻璃化冷冻保存液B中进行降温处理，当温度降低至0
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—10℃时，进行超声波处理3
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5秒，其后关闭超声波，正常降温处理60
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90s，最后放入液氮中保存；
[0012]其中，所述平衡液为含海藻糖和人血清白蛋白的DPBS缓冲液；
[0013]所述玻璃化冷冻保存液A包括甘油、海藻糖和维生素E；
[0014]所述玻璃化冷冻保存液B包括甘油、海藻糖、维生素C和脯氨酸。
[0015]上述方案中，先将待冻存的鹿茸生茸区骨膜先放入含有海藻糖和人血清白蛋白的DPBS缓冲液中平衡5
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7分钟，其次将平衡后的鹿茸生茸区骨膜放入玻璃化冷冻保存液A中，其中，甘油为渗透性冷冻保护剂，海藻糖为非渗透性冷冻保护剂，在甘油和超声波的作用下能够使非渗透性冷冻保护剂海藻糖渗透进鹿茸生茸区骨膜的细胞内，其次，通过维生素E对细胞膜进行保护，减少细胞在冷冻过程中受到氧化而导致细胞凋亡，同时维生素E和甘油的共同作用，能够使鹿茸生茸区骨膜始终保持原有的物性，防止其在冷冻过程中发生阻止冻伤的情况；其后将使鹿茸生茸区骨膜放入玻璃化冷冻保存液B中进行冷冻，在冷冻过程中，维生素C和E的共同作用，能够提高干细胞活力和抗凋亡基因的表达，从而保护细胞免受冷冻损，提高细胞存活率；而在超声波产生的空化作用下，能够使冷冻过程中产生的大冰晶破碎，从而避免或者减少细胞内外冰晶的形成，进而提高细胞的存活率；同时因细胞内渗透进玻璃化冷冻保存液A的原因，能够减少细胞内外的电解质浓度差，从而保护细胞免受降温过程中高浓度电解质造成的损伤，同时玻璃化冷冻保存液A也能够使细胞内的水分不过分外渗，从而有效避免冻存细胞和骨膜组织脱水和皱缩。此外，整个方案中均未添加对细胞具有毒性的DMSO，且加入的细胞冷冻保护剂能够进一步降低细胞的凋亡水平，提高鹿茸生茸区骨膜在复苏后的活性。
[0016]优选的，所述平衡液为300
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400mmol/L的海藻糖和15
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20％人血清白蛋白的DPBS缓冲液。该参数下的平衡液粘度适中，能够使鹿茸生茸区骨膜得以顺畅清洗，同时保持骨膜组织内外渗透压一致，确保骨膜组织的完整性。
[0017]优选的，所述玻璃化冷冻保存液A包括10
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15v/v％甘油、210
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500mmol/L海藻糖和20
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25微克/mL维生素E。上述方案中，通过调节璃化冷冻保存液A中的冷冻保存剂的剂量，能够使海藻糖进入细胞膜内的量与冷冻过中的浓度相适配，避免冷冻过程中细胞内外渗透压相差过大，导致细胞严重脱水而凋亡。
[0018]优选的，所述玻璃化冷冻保存液B包括7.5
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10v/v％甘油、200
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300mmol/L海藻糖、10
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15微克/mL维生素C 500
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900mmol/L脯氨酸。
[0019]上述方案中，通过调节璃化冷冻保存液B中的冷冻保存剂的剂量，能够使干细胞外的海藻糖和细胞内的海藻糖浓度保持一致，确保在冷冻过程中，通过流失璃化冷冻保存液A中的水分代替细胞液中的水分，避免细胞内外渗透压在短时间不会相差过大，而导致细胞严重脱水而凋亡。
[0020]优选的，所述平衡液为400mmol/L的海藻糖和20％人血清白蛋白的DPBS缓冲液；所述玻璃化冷冻保存液A包括12v/v％甘油、450mmol/L海藻糖和25微克/mL维生素E；所述玻璃化冷冻保存液B包括10v/v％甘油、300mmol/L海藻糖、12微克/mL维生素C和800mmol/L脯氨酸。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鹿茸生茸区骨膜的冷冻保存方法，其特征在于，包括如下步骤：S1将待冻存的鹿茸生茸区骨膜放入平衡液中平衡5
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7min；S2将步骤S1中经平衡后的鹿茸生茸区骨膜放入玻璃化冷冻保存液A中，其后经超声波处理3
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5min；S3将步骤S2中经超声波处理后的鹿茸生茸区骨膜放入玻璃化冷冻保存液B中进行降温处理，当温度降低至0
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—10℃时，进行超声波处理3
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5秒，其后关闭超声波，正常降温处理60
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90s，最后放入液氮中保存；其中，所述平衡液为含海藻糖和人血清白蛋白的DPBS缓冲液；所述玻璃化冷冻保存液A包括甘油、海藻糖和维生素E；所述玻璃化冷冻保存液B包括甘油、海藻糖、维生素C和脯氨酸。2.根据权利要求1所述的一种鹿茸生茸区骨膜的冷冻保存方法，其特征在于，所述平衡液为300
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400mmol/L的海藻糖和15
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20v/v％人血清白蛋白的DPBS缓冲液。3.根据权利要求1所述的一种鹿茸生茸区骨膜的冷冻保存方法，其特征在于，所述玻璃化冷冻保存液A包括10
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15v/v％甘油、210
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500mmol/L海藻糖和20
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25微克/mL维生素E。4.根据权利要求1所述的一种鹿茸生茸区骨膜的冷冻保存方法，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：李吉萍，胡鹏飞，李春义，
申请(专利权)人：长春科技学院，
类型：发明
国别省市：