与CD117/c-KIT和CD3结合的双特异性结合剂制造技术

本发明专利技术涉及包含至少第一结合结构域和第二结合结构域的双特异性结合剂，其中所述第一结合结构域结合CD117/c

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】与CD117/c
‑
KIT和CD3结合的双特异性结合剂


[0001]本申请涉及与CD117/c
‑
KIT和CD3结合的双特异性结合剂。

技术介绍

[0002]双特异性抗体能够将T细胞活性重新定向到靶细胞，代表了一类有效的抗体产品，以实现体内选择性杀生物作用。在T细胞存在的情况下，双特异性抗体可以在亚纳摩尔浓度下杀死靶细胞[15]。一种能够同时识别人CD19和CD3抗原的双特异性抗体产品(blinatumomab)已获得上市许可，用于治疗费城染色体阴性的复发性或难治性B细胞前体急性淋巴细胞白血病(ALL)[16]。Blinatumomab是一种双特异性T细胞接合剂(BiTE
TM
)，一种通过两个单链Fv抗体片段的顺序融合产生[17,18]的重组抗体形式。
[0003]自我更新和未成熟的造血干细胞和祖细胞(HSCP)在造血过程中产生骨髓和淋巴谱系[1]。单个造血干细胞也可能是血液系统恶性肿瘤的起源，例如急性髓系白血病(AML)和骨髓增生异常综合征(MDS)[2,3]。这些病症通常难以治疗，因为通过治疗干预难以区分AML和祖细胞，或者特别激进的治疗方案存在清髓风险。
[0004]预处理后HSCT为特征的治疗方法可能是一些AML患者的救命选择。以高剂量化疗为基础的调理，然后进行造血干细胞移植可能导致癌症治愈，但与大量毒性和不可忽略的死亡率相关[4]。这种治疗程序通常将不适合积极化疗方案的患者(例如老年患者)排除在外，他们宁愿在姑息治疗中接受低甲基化药物治疗[5]。积极的预处理方案也可能导致AML患者的骨髓抑制时间延长，就其对感染的易感性而言具有潜在的负面影响[6]。由于这些原因，大量的研究工作正致力于发现更具选择性的预处理策略和对AML细胞具有有效杀生物活性的药剂[7,8]。
[0005]已提出用单克隆抗体选择性靶向CD117(c
‑
Kit)作为去除内源性HSPC(造血干细胞和祖细胞)的策略，从而实现有效但温和的预处理。Irving Weissmann及其同事已经证明，在免疫功能低下[9]和免疫功能正常[7]的小鼠中，使用针对c
‑
Kit抗原的IgG形式的单克隆抗体可以有效消除HSPC。这种可以通过与抗CD47抗体的组合来增强的介入程序最近已被转化为临床环境，其使用抗试剂盒治疗抗体(AMG 191)(TAB
‑
470CL)作为炎症性疾病的潜在疗法，并且还可能在严重联合免疫缺陷(SCID)患者的造血干细胞移植之前启用更温和的调理方法[10]。临床前药物KTN0182A是一种抗KIT、含有吡咯并苯二氮卓(PBD)的抗体
‑
药物偶联物，在体外和体内对多种肿瘤类型均显示出抗肿瘤活性。然而，到目前为止，还没有这样的产品进入市场。
[0006]因此，本专利技术的一个目的是改进患有肿瘤疾病的患者的治疗选择。
[0007]本专利技术的另一个目的是为患有CD117阳性疾病的患者提供进一步的治疗选择。
[0008]本专利技术的另一个目的是为患有急性髓系白血病(AML)或骨髓增生异常综合征(MDS)的患者提供进一步的治疗选择。
[0009]这些和进一步的目的根据本专利技术的独立权利要求的方法和装置满足。从属权利要求涉及特定实施方案。

技术实现思路

[0010]本专利技术提供了一种双特异性结合剂，其至少包含第一结合结构域和第二结合结构域，其中所述第一结合结构域结合CD117/c
‑
KIT并且其中所述第二结合结构域结合CD3。以下将详细讨论本专利技术及其特征和实施方案的一般优点。
附图说明
[0011]图1：CD117xCD3的克隆、表达和表征
[0012](A)CD117xCD3的链排列。c
‑
Kit抗体79D[19]以VL
79D
‑
接头
‑
VH
79D
的链顺序克隆，并以VH
BlinCD3
‑
VL
BlinCD3
的顺序遗传融合到抗CD3抗体OKT3的人源化版本，本文称为BlinCD3。这种双特异性结合剂的一个示例性序列在本文中显示为SEQ ID NO 25(SEQ ID NO 34还包含信号肽和His标签)。将得到的构建体克隆到哺乳动物表达载体pcDNA3.1(+)中。(B)CD117xCD3蛋白的示意图。融合蛋白的N端标为(N')，而His6标签位于C端。(C)纯化的双特异性抗体的SDS
‑
PAGE，显示以约55kDa的预期(单体)大小迁移。M＝标记，NR＝非还原条件。(D)纯化产物的质谱分析显示2053道尔顿的单个N
‑
糖基化，证实了53475Da的理论质量(另参见图7)。(E)在Biacore实验中，CD117xCD3在指定浓度下与重组靶抗原人c
‑
Kit的结合。
[0013]图2：靶细胞的CD117表达和CD117xCD3针对细胞系的生物体外活性
[0014](A)HL60靶细胞系的FACS谱，显示不同水平的CD117表达，其由c
‑
Kit转导程序产生。(B)靶细胞系上抗原密度的定量分析。HL60
low
、HL60
med
和HL60
high
细胞显示分别表达7909
±
960、25146
±
2964和114597
±
11450个拷贝的靶抗原CD117。(C)靶细胞系的特异性裂解取决于CD117xCD3的浓度以及靶抗原密度。效应子(人类细胞)与目标物(具有不同c
‑
Kit表达水平的HL60细胞系)的比例为10:1。(D)在1μg/ml的固定CD117xCD3浓度下，效应物与目标物的比例从1:20变化到20:1。
[0015]图3：CD117xCD3的生物体外活性
[0016]靶细胞系HL60
low
、HL60
med
和HL60
high
的特异性裂解取决于双特异性抗体的浓度和抗原密度。添加IL
‑
2以增强基线T细胞活化并没有显著改变裂解活性。
[0017]图4：CD117xCD3对原代骨髓样本和患者AML样本的生物体外活性
[0018](A)来自健康供体的三个不同骨髓样本(BM#249、BM#333、#BM 351)中的CD117表征揭示了细胞间不同的抗原密度。(B)在存在人T细胞和双特异性抗体浓度范围(10ng/ml、100ng/ml和1000ng/ml)的情况下对来自(A)的骨髓样本进行特异性裂解。(C)对三种不同AML患者样本的分析显示样本内和患者间比较中的CD117表达变异性(显示了CD45
dim
胚细胞)。(D)在存在自体T细胞的情况下以浓度依赖性方式特异性裂解(C)的胚细胞样品。所有6个样本(B+本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种双特异性结合剂，所述结合剂至少包含第一结合结构域和第二结合结构域，其中所述第一结合结构域结合CD117/c
‑
KIT，且其中所述第二结合结构域结合CD3。2.根据权利要求1的双特异性结合剂，其中所述第一结合结构域结合CD117/c
‑
KIT的细胞外结构域和/或所述第二结合结构域结合CD3的ε链和/或CD3的γ链。3.根据前述权利要求中任一项的双特异性结合剂，其为全长抗体或抗体片段的形式。4.根据前述权利要求中任一项的双特异性结合剂，其为至少一种选自以下的形式：
·
DVD
‑
Ig
·
Knobs in Holes
·
Crossmab
·
BiTE
TM
·
Nanobody
·
Diabody
·
DART
TM
·
TandAb
TM
，和/或
·
scDb
‑
scFv。5.根据前述权利要求中任一项的双特异性结合剂，其中结合CD117/c
‑
KIT的第一结合结构域a)包含一组重链/轻链互补决定区(CDR)，该组重链/轻链互补决定区(CDR)包含在抗CD117抗体79D的如SEQ ID NO 19和20所示的重链/轻链可变区序列对中，b)包含一组包含以下序列的重链/轻链互补决定区(CDR)HC CDR1(SEQ ID NO 1或35)HC CDR2(SEQ ID NO 2或36)HC CDR3(SEQ ID NO 3或37)LC CDR1(SEQ ID NO 4或38)LC CDR2(SEQ ID NO 5或39)，和LC CDR3(SEQ ID NO 6或40)c)包含b)的重链/轻链互补决定区(CDR)，条件是至少一个CDR相对于对应的SEQ ID NO 1
‑
6或SEQ ID NO 35
‑
40具有至多3个氨基酸取代，和/或d)包含b)的重链/轻链互补决定区(CDR)，条件是至少一个CDR与对应的SEQ ID NO 1
‑
6或SEQ ID NO 35
‑
40具有≥66％的序列同一性，其中所述CDR嵌入合适的蛋白质框架中，以便能够结合CD117/c
‑
KIT。6.根据前述权利要求中任一项的双特异性结合剂，其中所述结合CD3的第二结合结构域a)包含一组重链/轻链互补决定区(CDR)，其包含以下序列OKT3，BlinCD3，b)包含一组重链/轻链互补决定区(CDR)，其包含在抗CD3抗体BlinCD3，OKT3和[
…
]之一的如SEQ ID NO 21和22，或SEQ ID NO 23和24所示的重链/轻链可变区序列对中，c)包含一组含有以下序列的重链/轻链互补决定区(CDR)HC CDR1(SEQ ID NO 7或41)HC CDR2(SEQ ID NO 8或42)
HC CDR3(SEQ ID NO 9或43)LC CDR1(SEQ ID NO 10或44)LC CDR2(SEQ ID NO 11或45)，和LC CDR3(SEQ ID NO 12或46)d)包含一组含有以下序列的重链/轻链互补决定区(CDR)HC CDR1(SEQ ID NO 13)HC CDR2(SEQ ID NO 14)HC CDR3(SEQ ID NO 15)LC CDR1(SEQ ID NO 16)LC CDR2(SEQ ID NO 17),和LC CDR3(SEQ ID NO 18)e)包含b)或c)的重链/轻链互补决定区(CDR)，条件是至少一个CDR相对于对应的SEQ ID NO 7
‑
12或SEQ ID NO 41或SEQ ID NO 13
‑
18具有至多3个氨基酸取代，和/或f)包含b)的重链/轻链互补决定区(CDR)，条件是至少一个CDR与对应的SEQ ID NO 7
‑
12或SEQ ID NO 41或SEQ ID NO 13
‑
18具有≥66％的序列同一性，其中所述CDR嵌入合适的蛋白质框架中，以便能够结合CD3。7.根据前述权利要求中任一项的双特异性结合剂，其中所述框架是人VH/VL框架。8.根据前述权利要求中任一项的双特异性结合剂，其中结合CD117/c
‑
KIT的第一结合结构域包含：a)抗体79D的可变结构域b)重链/轻链可变结构域(VD)
·
HC VD(SEQ ID NO 19)，和
·
LC VD(SEQ ID NO 20)c)b)的重链/轻链可变结构域(VD)，其前提是所述HCVD与相应的SEQ ID NO 19具有≥80％的序列同一性，和/或所述LCDVD与相应的SEQ ID NO 20具有≥80％的序列同一性，d)b)的重链/轻链可变结构域(VD)，条件是HCVD或LCVD中的至少一个相对于相应的SEQ ID NO 19和/或20具有至多10个氨基酸取代，所述双特异性结合剂仍然能够结合CD117/c
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KIT。9.根据前述权利要求中任一项的双特异性结合剂，其中结合CD3的第二结合结构域包含：a)选自OKT3和BlinCD3的一种抗体的可变结构域，b)重链/轻链可变结构域(VD)
·
HC VD(SEQ ID NO 21或23)，和
·
LC VD(SEQ ID NO 22或24)c)b)的重链/轻链可变结构域(VD)，其前提是
·
所述HCVD与相应的SEQ ID NO 21或23具有≥80％的序列同一性，和/或
·
所述LCDVD与相应的SEQ ID NO 22或24具有≥80％的序列同一性d)b)的重链/轻链可变结构域(VD)，条件是HCVD或LCVD中的至少一个相对于相应编号
的序列具有至多10个氨基酸取代，所述双特异性结合剂...

【专利技术属性】
技术研发人员：J，
申请(专利权)人：ETH苏黎世公司，
类型：发明
国别省市：