M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶及其制备方法与应用，M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶的制备方法为：1)将M1型巨噬细胞裂解液冻干粉加入无菌水中配成溶液；2)将EDC和交联剂溶液混合，振荡，离心，静置；放在冰浴中，加入NHS，振荡，离心；3)在冰浴中，将步骤1)获得的溶液与步骤2)获得的液体混合，再振荡，离心，倒入模具中，在

【技术实现步骤摘要】
M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶及其制备方法与应用


[0001]本专利技术属于材料
，具体设计一种具有微米多孔结构的M1巨噬细胞裂解液基水凝胶及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]水凝胶是一种三维聚合物具有亲水网络，广泛用于蛋白质、肽、药物和核酸的包裹和控制释放。同时水凝胶具有良好的仿生性，它的含水量高使其表面张力降低，可以减少细胞和蛋白在其表面的粘附，其次水凝胶柔软且具有孔隙，可以降低它与周围组织的力学摩擦，如果将其应用于人体内，可以减少或避免发生炎症反应，因而在生物医药领域中具有广泛的应用。
[0003]肿瘤相关巨噬细胞(TAM)是浸润在肿瘤组织中的巨噬细胞，是肿瘤微环境中最多的免疫细胞，可以分泌多种细胞因子，在肿瘤发生的初期，能够识别并清除肿瘤细胞，但随着肿瘤的发生发展，又对肿瘤的生长、侵袭、转移起着关键作用。M1型巨噬细胞高表达白介素
‑
12(IL
‑
12)、一氧化氮(NO)、活性氧(ROS)等杀伤分子、多种促炎细胞因子(IL
‑
1、IL
‑
6、IL
‑
13和TNF
‑
α等)及趋化因子(CCL2、CCL3、CXCL
‑
10等)[van Dalen FJ,van Stevendaal MHME,Fennemann FL,Verdoes M,Ilina O.Molecular repolarisation of tumour
‑
associated macrophages.Molecules.(2018)24:E9.10.3390/molecules24010009]。M1型巨噬细胞通过释放促炎因子、免疫激活因子、趋化因子引起急性促炎反应、免疫活化反应以及细胞吞噬功能，发挥抗肿瘤的作用。但直接注射M1型巨噬细胞会产生急性炎症[Yeung WHO,Lo CM,Ling CC,et al.Alternatively activated(M2)macrophages promote tumor growth and invasiveness in hepatocellular carcinoma.J Hepatol.2015；62:607
‑
16.]，因此亟需一种副作用小的M1型巨噬细胞裂解液的制剂。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶。
[0005]本专利技术的第二个目的是提供一种M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶的制备方法。
[0006]本专利技术的第三个目的是提供一种M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶在制备抗癌药物中的应用。
[0007]本专利技术的技术方案概述如下：
[0008]M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
[0009]1)将M1型巨噬细胞裂解液冻干粉加入无菌水中配成质量浓度为10％～20％的M1型巨噬细胞裂解液溶液；
[0010]2)将EDC和交联剂溶液混合，在室温下振荡10～20s，离心5～10s，静置10
‑
30分钟；放在冰浴中，加入NHS，再在室温下振荡10～20s，离心5～10s；
[0011]3)在冰浴中，将步骤1)获得的溶液与步骤2)获得的液体混合，再在室温下振荡10～20s，离心5～10s，倒入模具中，在
‑
16～
‑
23℃放置24小时～48小时，得到M1型巨噬细胞裂
解液基水凝胶；
[0012]所述EDC、交联剂与NHS的质量比为5
‑
25:100
‑
500:3
‑
20；
[0013]所述交联剂与M1型巨噬细胞裂解液溶液的质量比为1～5：1～3；
[0014]所述EDC为1
‑
乙基
‑3‑
(3
‑
二甲基氨丙基)
‑
碳化二亚胺的缩写；
[0015]所述NHS为N
‑
羟基琥珀酰亚胺的缩写。
[0016]M1型巨噬细胞裂解液冻干粉用下述方法制成：
[0017]将LPS加入到M0型巨噬细胞的培养液中，使终浓度为80～120ng/mL；放置24～48小时，诱导分化得到M1型巨噬细胞，用pH＝7.2
±
0.5PBS清洗2～3次，用pH＝7.2
±
0.5PBS将M1型巨噬细胞吹打下来，加入离心管中计数，在1000rpm转速下离心3～5分钟，弃上清，每2.0
×
107个细胞用100ul的无菌水吹匀，通过液氮冷冻，再在37℃水浴中融解，反复冻融3～5次，在400rpm转速下离心10～15分钟，收集上清液，冷冻干燥获得M1型巨噬细胞裂解液冻干粉，在
‑
80℃中保存。
[0018]所述交联剂溶液的溶剂为pH＝7.2
±
0.5的磷酸缓冲液，交联剂溶液的质量浓度为2％。
[0019]交联剂为粘均分子量≥2000cps的海藻酸钠、数均分子量100000～200000透明质酸或数均分子量100000的聚丙烯酸。
[0020]上述制备方法制备的M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶。
[0021]上述M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶在制备抗癌药物中的应用。
[0022]本专利技术的优点：
[0023]本专利技术的一种具有微米多孔结构的M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶所用主要原料是M1型巨噬细胞，富含多种杀伤分子、促炎因子(IL
‑
12、ROS、TNF
‑
α、IFN
‑
γ等)。
[0024]本专利技术的方法简单易操作，低温环境易于M1型巨噬细胞中活性组分的保存。M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶能缓慢释放多种杀伤分子，细胞因子促进M2型巨噬细胞向M1型巨噬细胞极化，具有抗肿瘤作用。
[0025]本专利技术以含羧基的水溶性高分子(如天然多糖透明质酸、海藻酸钠等或合成聚合物聚丙烯酸等)为交联剂，通过M1巨噬细胞裂解液中氨基与交联剂羧基之间的酰胺反应，在低温下制备具有微米多孔结构的M1巨噬细胞裂解液基水凝胶。
附图说明
[0026]图1为实施例5制备的水凝胶的照片。
[0027]图2为M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶的共聚焦显微镜照片，其中(A)为实施例4制备；(B)为实施例5制备。
[0028]图3为M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶的扫描电镜照片，其中(A)为实施例4制备；(B)为实施例5制备。
[0029]图4中的(A)为实施例4、实施例5制备的水凝胶的模量表征。(B)实施例4、实施例5制备的水凝胶的降解。
[0030]图5实施例5制备的水凝胶和对照组凝胶的溶胀率(A)；实施例5制备的水凝胶和对照组凝胶的孔隙率(B)。
[0031]图6实施例5制备的水凝胶生物活性分子释放曲线，(A)IFN...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶的制备方法，其特征在于包括如下步骤：1)将M1型巨噬细胞裂解液冻干粉加入无菌水中配成质量浓度为10％～20％的M1型巨噬细胞裂解液溶液；2)将EDC和交联剂溶液混合，在室温下振荡10～20s，离心5～10s，静置10
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30分钟；放在冰浴中，加入NHS，再在室温下振荡10～20s，离心5～10s；3)在冰浴中，将步骤1)获得的溶液与步骤2)获得的液体混合，再在室温下振荡10～20s，离心5～10s，倒入模具中，在
‑
16～
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23℃放置24小时～48小时，得到M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶；所述EDC、交联剂与NHS的质量比为5
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25:100
‑
500:3
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20；所述交联剂与M1型巨噬细胞裂解液溶液的质量比为1～5：1～3；所述EDC为1
‑
乙基
‑3‑
(3
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二甲基氨丙基)
‑
碳化二亚胺的缩写；所述NHS为N
‑
羟基琥珀酰亚胺的缩写。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述M1型巨噬细胞裂解液...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓俊杰，李婉毓，杨慧龄，王丹，林坚涛，
申请(专利权)人：中国科学院大学温州研究院温州生物材料与工程研究所，
类型：发明
国别省市：