用于生物聚合物鉴定的装置和方法制造方法及图纸

本发明专利技术提供了基于体外模板导向的酶促复制或合成的用于生物分子测序或鉴定的纳米结构装置和方法。构装置和方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于生物聚合物鉴定的装置和方法


[0001]本专利技术的实施方式涉及利用电子信号测序或鉴定生物聚合物的系统、方法、装置、和组合物。更具体地，本公开包括教导构建系统以基于酶活(包括复制)以电子方式检测生物聚合物的实施方式。本专利技术中的生物聚合物包括但不限于天然或合成的DNA、RNA、DNA寡核苷酸、蛋白质、肽、多糖等。酶包括但不限于天然的、突变的或合成的DNA聚合酶、RNA聚合酶、DNA解旋酶、DNA连接酶、DNA外切核酸酶、逆转录酶、RNA引物酶、核糖体、蔗糖酶、乳糖酶等。在下文中，主要讨论并使用DNA和DNA聚合酶以说明本专利技术概念。
[0002]专利技术背景
[0003]通过酶促合成进行DNA测序可以追溯到桑格的链终止法，该方法在靶序列的体外复制期间通过DNA聚合酶把双脱氧核苷酸选择性地纳入DNA中。
1，2
这种酶促方法已经以高通量或实时方式扩展到下一代测序(NGS)。
3，4
尽管NGS已经将人类基因组测序的成本降低到$1000的范围，但最近的数据显示成本的降低可能已经达到了最低水平(https：//www.genome.gov/27565109/the
‑
cost
‑
of
‑
sequencing
‑
a
‑
human
‑
genome)。限制因素之一是NGS依赖于光学信号检测，这需要笨重且昂贵的精密仪器。
[0004]无标记检测刺激了聚合酶对DNA合成的电子读取5，该检测已经被开发为用于基因组测序的平台。6最近的进展表明电子方法可以是手持设备，例如MinION测序仪(www.nanoporetech.com)，其可测量通过蛋白质纳米孔的离子电流变化进行DNA测序，其中DNA解旋酶用于控制DNA通过纳米孔的易位。7然而，蛋白质纳米孔只能实现低测序准确度(单次读取85％8)。Gundlach及其同事已经证明，由耻垢分枝杆菌孔蛋白A(称为MspA)构成的蛋白质纳米孔中的离子电流阻塞是四个核苷酸(四聚体)的集合事件，因此有44(即256)种可能的四聚体产生大量的冗余电流水平。
9，10
由于离子电流受到纳米孔内核苷酸之外的核苷酸的影响，
11
用于测序的原子级薄纳米孔的概念可能无法实现单核苷酸分辨率。
[0005]Collins及其同事报道了一种单壁碳纳米管(SWCNT)场效应晶体管(FET)装置，其上系有DNA聚合酶I的Klenow片段以监测其DNA合成。
12，13
在该方法中，当核苷酸被纳入DNA链时，记录了低于平均基线电流的ΔI(t)的短暂偏移。酶纳入不同的核苷酸会导致ΔI的差异。该方法有可能用于DNA测序。碳纳米管是一种仅由锁定在六边形网格中的单层碳原子制成的材料。由于刚性的化学结构，它的感应可能大部分依赖于靠近蛋白质附着位点的带电侧链的静电门控运动。然而，该装置中使用的碳纳米管长度为0.5
‑
1.0μm，
14
这对在其上可重复地安装单个蛋白质分子提出了挑战。现有技术(WO 2017/024049)揭示了用于DNA测序的纳米级场效应晶体管(nanoFET)，其中DNA聚合酶被固定，其核苷酸出口区域朝向碳纳米管栅极，具有一组多磷酸酯标记核苷酸，该标记用于鉴定纳入的核苷酸(图1)。
[0006]另一项专利技术(US 2017/0044605)已经揭示了一种使用固定在生物聚合物上的聚合酶测序DNA和RNA的电子传感器装置，该聚合酶桥接两个分离的电极(图2)。另外，单个酶直接连接正极和负极完成通路，使得所有电流必定流经该分子(US 2018/0305727，WO 2018/208505)。但是，酶可以与电极有两个以上的接触点。
[0007]DNA在分子电子学中引起了极大的关注，因为其独特的碱基堆叠结构使DNA成为电
荷转移(CT)的细分子线。此外，DNA的序列和长度是可编程的，能够形成无错自组装纳米结构(例如DNA折纸)，无需昂贵的微细加工技术，这使其成为纳米级集成电路的理想候选。在过去的几十年中，核酸(DNA和RNA)的程序化自组装已经被开发出来用于纳米结构的构建。
15，16
通常，复杂的DNA纳米结构是从分子基序开始组装的，如霍利迪结(Holliday junction)、
17，18
多臂结、
19
双交叉(DX)和三交叉(TX)块(tile)、
20，21
平行交叉(paranemic crossover)(PX)、
22
张力完整性三角(tensegrity triangle)、
23
六螺旋束、
24
和单链环状DNA或DNA折纸(图3)。
25
用这些DNA基序可以容易地构建各种大小和形状可调的纳米结构。DNA纳米结构的刚性比碳纳米管弱，但比DNA双链体或分子线更具刚性。它也可以以类似于DNA双链体的方式被官能化。它为电子生物传感器的构造提供了独特的试验模型(breadboard)，设计结构以具有所需的电导率、电流波动或其他电学性质。据测量，在90％相对湿度下，10
×
60nm
2 TX块纳米结构在45
‑
55nm纳米间隙中具有～70pS的电导。
26
因此，由DNA纳米结构桥接的纳米间隙可用来构建用于分子电子检测或鉴定的纳米生物装置。可以设想，DNA纳米结构的电导率可以通过其序列、构型和结构动力学进行调整。类似地，RNA纳米结构是使用RNA基序(图4)通过自组装构建而成。
27，28
RNA在结构和功能上比DNA更多样化，并且RNA双链体比DNA的对应物在热力学上更稳定。因此，RNA纳米结构可以是对应DNA纳米结构的替代。已经证明RNA也可以介导电子转移。
29
[0008]为了编程经典核碱基之外的DNA，最近，Steven Benner和他的同事创建了8核苷酸DNA/RNA基因系统，称为Hachimoji系统。
56
除了四种天然存在的DNA核苷酸，A、C、G和T，他们创造了四种另外的非天然DNA核苷酸，P、B、S、Z，其中P与Z配对(P:Z)，B与S配对(B：S)，类似于G:C和A:T配对，其中P和B是嘌呤类似物，Z和S是嘧啶类似物，P是2
‑
氨基
‑8‑
(1
’‑
β
‑
D
‑2’‑
脱氧呋喃核糖基)
‑
咪唑并
‑‑
1，3，5
‑
三嗪
‑
[8H]‑4‑
酮，B是6
‑
氨基
‑
9[(1
’‑
β
‑
D
‑2’‑
脱氧呋喃核糖基)
‑4‑
羟基
‑5‑
(羟基甲基)...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于生物聚合物鉴定、表征或测序的系统，其包括，(a)非导电性基材；(b)第一电极和第二电极彼此相邻放置在所述非导电性基材上形成的纳米间隙；(c)通过化学键将一端附接所述第一电极，另一端附接所述第二电极桥接所述纳米间隙的纳米结构，其中所述纳米结构包括核酸，其为脱氧核糖核酸(DNA纳米结构)或核糖核酸(RNA纳米结构)或其组合，其中所述核酸的碱基是非天然核酸碱基或所述核酸包括非天然和天然核酸碱基的混合物；(d)附接到进行生化反应的所述纳米结构上的酶；(e)施加在所述第一电极和所述第二电极之间的偏压；(f)记录通过所述纳米结构的电流波动的装置，所述电流波动是由附接到所述纳米结构上的酶引发的构象改变导致的所述纳米结构内部变形导致的；和(g)用于数据分析鉴定或表征所述生物聚合物或所述生物聚合物的亚单位的软件。2.如权利要求1所述系统，其中所述非导电性基材选自下组：硅、氧化硅、氮化硅、玻璃、二氧化铪、其他金属氧化物、任意非导电性聚合物薄膜、具有氧化硅或氮化硅或其他非导电性涂层的硅、具有氮化硅涂层的玻璃、其他非导电性有机材料、任意非导电性无机材料，及其组合。3.如权利要求1所述的系统，其中所述生物聚合物选自下组：DNA，RNA，寡核苷酸，蛋白质，肽，多糖，天然的、修饰的或合成的任何上述生物聚合物，及其组合。4.如权利要求1所述的系统，其中所述酶选自下组：DNA聚合酶，RNA聚合酶，DNA解旋酶，DNA连接酶，DNA外切核酸酶，逆转录酶，RNA引物酶，核糖体，蔗糖酶，乳糖酶，天然的、突变的、表达的或合成的任何上述酶，及其组合。5.如权利要求4所述的系统，其中所述酶选自下组：T7 DNA聚合酶，Taq聚合酶，DNA聚合酶Y，DNA聚合酶Pol I，Pol II，Pol III，Pol IV和Pol V，Polα(阿尔法)，Polβ(贝塔)，Polσ(西格玛)，Polλ(兰姆达)，Polδ(德尔塔)，Polε(艾普希龙)，Polμ(缪)，Polι(埃欧塔)，Polκ(卡帕)，polη(艾塔)，末端脱氧核苷酸转移酶，端粒酶，天然的、突变的、表达的或合成的任何上述酶，及其组合。6.如权利要求4所述的系统，其中所述DNA聚合酶是天然的、突变的、表达的或合成的Φ29 DNA聚合酶。7.如权利要求1所述的系统，其中形成所述纳米间隙的所述两个电极由约3nm至约1000nm的距离分隔；和其中所述电极的所述末端具有基本矩形面，宽度为约3nm至约1000nm，深度为约2nm至约1000nm。8.如权利要求1所述的系统，其中形成所述纳米间隙的所述两个电极由约5nm至约50nm的距离分隔；和其中所述电极的所述末端具有基本矩形面，宽度为约10nm至约30nm，深度为约5nm至约20nm。9.如权利要求1所述的系统，其中所述电极包括：a)可与硫醇、胺、硒醇和其他有机官能团反应的金属电极；b)可以通过可与锚定分子反应形成共价键的自组装单层在所述表面上被官能化的金
属电极；c)可以用硅烷官能化的金属氧化物电极，其可以与所述锚定分子反应形成共价键；或d)可以用有机试剂官能化的碳电极，所述有机试剂能与所述锚定分子反应形成共价键。10.如权利要求1所述的系统，其中除了面对所述纳米间隙的所述末端表面之外，所述电极和所述基材被绝缘层钝化。11.如权利要求10所述的系统，其中所述绝缘层也包括单层或多层惰性化学品或被单层或多层的惰性化学品钝化。12.如权利要求11所述的系统，其中所述惰性化学品包括用于金属表面钝化的11
‑
巯基十一烷
‑
六甘醇(CR
‑
1)，和用于基材表面钝化的氨基丙基三乙氧基硅烷(CR
‑
2)以及N
‑
羟基琥珀酰亚胺2
‑
(ω
‑
O
‑
甲氧基
‑
六甘醇)乙酸酯(CR
‑
3)。13.如权利要求1所述的系统，其中所述非天然核酸碱基选自下组(a)Hachimoji核酸碱基；(b)尺寸扩大的核碱基；(c)非氢键合核碱基；(d)通用碱基；和(e)其组合。14.如权利要求1所述的系统，其中所述核酸纳米结构包括下述的其中之一或其组合：(a)未配对的或非配对的核酸碱基；或(b)有机超导体。15.如权利要求1所述的系统，其中所述核酸纳米结构是由线性或环状DNA(DNA纳米结构)；或线性或环状RNA(RNA纳米结构)或其组合自组装而成。16.如权利要求1所述的系统，其中所述核酸纳米结构具有下述构型之一或其组合：(a)基本一维几何形状，包括但不限于，线性DNA双链体结构，线性RNA双链体结构，线性核酸分子线，螺旋形或非螺旋形，或其组合；(b)基本二维几何形状，包括但不限于，基本矩形结构、基本正方形结构、基本三角形结构、基本环形结构或其组合；和(c)基本三维几何形状，包括但不限于，基本圆柱形结构、基本中空管结构、基本柱状结构、包括基本柱束结构的几何形状、包括基本堆叠二维结构的几何形状、包括基本折叠的折纸状结构的几何形状或其组合。17.如权利要求1所述的系统，其中，所述纳米结构包括：a.包含酰胺、胍或三唑连接的非磷酸酯骨架；b.糖修饰的核苷或核苷类似物；c.核碱基修饰的核苷或核苷类似物；和/或d.核碱基类似物。18.如权利要求1所述的系统，其中，所述纳米结构包括：a.配置用于附接到电极的官能团；和/或
b.配置用于固定所述酶的官能团。19.如权利要求18所述的系统，其中，所述配置用于电极附接的官能团包括(a)核苷糖环上的硫醇；(b)核苷核碱基上的硫醇和硒醇；(c)核苷上的脂肪胺；和/或(d)核苷上的儿茶酚；(e)RXH或RXXR，R是脂肪族或芳香族基团；X是硫族元素优选S和Se；和/或(f)碱基硫族化核苷，以及其中配置用于固定所述酶的所述官能团包括：(a)通过化学或酶促合成被纳入DNA或RNA的胺官能化核苷；(b)通过化学或酶促合成被纳入DNA和RNA的环辛炔和/或衍生物官能化核苷；和/或(c)通过化学或酶促合成被纳入DNA和RNA的儿茶酚官能化核苷。20.如权利要求9所述的系统，其中所述锚定分子包括下述的其中之一或其组合：(a)配置为通过多价键与金属表面相互作用的分子；(b)配置为通过三价键与金属表面反应的三脚架结构；和(c)由四苯基甲烷核构成的分子，其中三个苯环由
‑
CH2SH或
‑
CH2SeH官能化，第四个苯环由叠氮化物、羧酸、硼酸和/或配置用于与纳入所述DNA和/或RNA纳米结构的官能团反应的有机基团官能化。21.如权利要求9所述的系统，其中所述锚定分子包括下述的其中之一或其组合：(a)N
‑
杂环碳烯(NHC)；(b)金属络合物中的N
‑
杂环碳烯(NHC)，其配置用于在溶液中通过电化学方法选择性沉积到阴极电极上；(c)N
‑
杂环碳烯(NHC)，其配置为用于在有机和/或水性溶液中沉积到两个金属电极上；和(d)N
‑
杂环碳烯(NHC)，其包含的官能团包括胺基、羧酸、硫醇、硼酸和/或配置用于附接的任何有机基团。22.如权利要求21所述的系统，其中所述金属络合物包括Au、Pd、Pt、Cu、Ag、Ti和/或其他过渡金属。23.如权利要求1所述的系统，还包括：配置成被固定在所述纳米间隙底部以支撑并稳定所述核酸纳米结构的蛋白质。24.如权利要求23所述的系统，其中所述纳米间隙的非导电性底部由化学试剂官能化以固定蛋白质，其中所述化学试剂包括：(a)配置为与氧化物表面反应的硅烷；(b)配置为与氧化物表面反应的毒鼠硅；(c)包含毒鼠硅和官能团的多臂接头；(d)包含金刚烷核心的四臂接头；(e)包含两个毒鼠硅和两个生物素部分的四臂接头；和/或(f)包含金刚烷核心和毒鼠硅和有机官能团的四臂接头。
25.如权利要求23所述的系统，其中所述蛋自质选自下组：抗体、受体、适体及其组合。26.如权利要求23所述的系统，其中所述蛋白质是链霉亲和素或亲和素，核酸纳米结构由生物素官能化。27.如权利要求1所述的系统，其中所述酶是具有配置用于附接所述纳米结构的正交官能团的重组逆转录酶或重组DNA聚合酶。28.如权利要求27所述的系统，其中所述重组DNA聚合酶包括(a)配置用于在所述DNA纳米结构上点击反应的N
‑
和/或C
‑
末端的有机基团；(b)配置用于在所述DNA纳米结构上点击反应的非天然的、修饰的或合成的氨基酸；(c)配置用于在所述DNA纳米结构上点击反应的N
‑
和/或C
‑
末端的叠氮基团；和/或(d)配置用于在所述DNA和/或RNA纳米结构上点击反应的2
‑
氨基
‑6‑
叠氮己酸(6
‑
叠氮基
‑
L
‑
赖氨酸)。29.如权利要求28所述的系统，其中所述核酸纳米结构包括(a)其糖环或核碱基由有机基团官能化用于点击反应的核苷；和/或(b)其糖环或核碱基由乙炔基团官能化用于点击反应的核苷。30.如权利要求27所述的系统，其中所述重组逆转录酶包括(a)配置用于在所述DNA纳米结构上点击反应的N
‑
和/或C
‑
末端的有机基团；(b)配置用于在所述DNA纳米结构上点击反应的非天然的、修饰的或合成的氨基酸；(c)配置用于在所述DNA纳米结构上点击反应的N
‑
和/或C
‑
末端的叠氮基团；和/或(d)配置用于在所述DNA和/或RNA纳米结构上点击反应的2
‑
氨基
‑6‑
叠氮己酸(6
‑
叠氮基
‑
L
‑
赖氨酸)。31.如权利要求1所述的系统，其中所述生化反应包括(a)以DNA为模板，以DNA核苷酸为底物，由DNA聚合酶催化的反应；和/或(b)以RNA为模板，以DNA核苷酸为底物，由逆转录酶催化的反应。32.如权利要求31所述的系统，其中所述DNA核苷酸包括(a)DNA/RNA核苷的多磷酸酯；(b)带有机分子标签的DNA/RNA核苷的多磷酸酯；(c)带嵌入剂标签的DNA/RNA核苷的多磷酸酯；(d)带小沟结合剂标签的DNA/RNA核苷的多磷酸酯；和/或(e)带药物分子标签的DNA/RNA核苷的多磷酸酯，其中所述多磷酸酯包含两个或更多磷酸酯单元。33.如权利要求32所述的系统，其中所述多磷酸酯是下述的其中之一或其组合：(a)带有结合到所述DNA纳米结构的1，8
‑
萘二酰亚胺标签的DNA核苷的六磷酸酯；或(b)带有结合到所述DNA纳米结构的1，8
‑
萘二酰亚胺的衍生物标签的DNA核苷的六磷酸酯。34.如权利要求1所述的系统包括多个纳米间隙，每个纳米间隙包括一对电极、酶、纳米结构和与权利要求1所述的单个纳米间隙相关的任何特征。35.如权利要求34所述的系统，其中所述多个纳米间隙包括约100个至约1亿个纳米间隙的阵列，优选约10,000个至近1百万个纳米间隙。36.如权利要求1所述的系统，其中所述核酸纳米结构选自下组：DNA纳米结构，其包含
以下的折纸基序：霍利迪结(HJ)、多臂结、双交叉(DX)块、三交叉(TX)块、平行交叉(PX)、张力完整性三角、六螺旋束和单链环状DNA及其组合，以及具有双链体、发夹、90
°‑
扭结、轻触茎环、开放3向结、开放4向结、堆叠3向结或3向茎环及其组合的DN...

【专利技术属性】
技术研发人员：张丕明，雷明，
申请(专利权)人：通用测序技术公司，
类型：发明
国别省市：