评估细胞培养介质上清液中生物分子还原风险的方法技术

本发明专利技术提供一种评估细胞培养介质上清液中生物分子还原风险的方法，所述方法包括：(1)确定生物分子拟阈值还原水平L

【技术实现步骤摘要】
评估细胞培养介质上清液中生物分子还原风险的方法


[0001]本专利技术一般涉及生物制药领域；具体地，涉及生物分子生产过程中还原风险的评估。

技术介绍

[0002]生物分子(例如，抗体)的还原现象常发生在细胞培养纯化的生产过程中，具体表现为在细胞培养液收获澄清后的放置期间，目标蛋白质(例如，抗体)的亚基间二硫键被还原为自由巯基，导致分子结构被破坏。
[0003]当前关于还原现象的机理研究已较为全面。还原的发生主要基于硫氧还蛋白(Trx)系统，或基于谷胱甘肽系统。在NADPH的存在下，蛋白质的二硫键在相关还原酶的作用下被还原为自由巯基。还原现象的产生主要归因于细胞破碎，致使有还原能力的细胞内容物释放到细胞培养液中。二硫键对于蛋白质分子折叠、构象和功能具有重要作用。二硫键的还原除了会影响蛋白质分子功能之外，还会产生蛋白质分子相关杂质，且可能影响产品稳定性。
[0004]在生物分子生产过程中，预防上述还原现象的发生至关重要。当前报道和采用的防还原措施主要有：通气(例如，空气或氧气)以提高溶氧，通气并降温、添加弱氧化剂(例如，硫酸铜)，或过氧化氢，或添加硫氧还蛋白还原酶抑制剂等。防还原措施的采取一方面增加了工艺操作的复杂性，另一方面还可能影响产品质量。例如已有报道提出，通气会造成生物分子酸性峰增加(参见例如，Mun Melissa等，Biotechnology and bioengineering，2015，112(4))；弱氧化剂的添加会增加不希望的生物分子氧化风险，抑制剂(如金属类抑制剂)的添加会带来后续去除的负担且可能对产品质量产生负面影响。因此，若非必要，尽量不采取防还原措施。如果温和措施满足要求，不采取强防还原措施。
[0005]本领域迫切需要评估细胞培养介质上清液中生物分子(例如，抗体)还原风险的方法，以为后续判断是否需要采取还原措施和有针对性地采取防还原措施提供有利支持。

技术实现思路

[0006]经长期研究，专利技术人发现并提出了评估细胞培养介质上清液中生物分子还原风险的方法。所述方法能够定性、定量地评估给定生物分子所处的细胞培养介质上清液的还原水平，准确预测生物分子发生还原的可能性及还原程度，以能够按需采用和选择适当的防还原措施。
[0007]所述方法特别地适合用于在目标蛋白质(例如，抗体)的大规模生产中实时、快速、准确地预测目标蛋白质(例如，抗体)还原风险，为后续防还原措施的选用提供必要信息，从而一方面避免目标蛋白质(例如，抗体)在生产过程中的结构的破坏，另一方面避免了不必要的防还原措施对目标蛋白质质量造成的不良影响，和避免了不必要增加生产工艺复杂性的影响。促进了产品产率和质量的提高。
[0008]一方面，本专利技术提供一种评估细胞培养介质上清液中生物分子还原风险的方法，
所述方法包括：
[0009](1)确定生物分子拟阈值还原水平L
th
；
[0010](2)测定所述细胞培养介质上清液的还原水平L
d
；和
[0011](3)比较L
d
与L
th
以判断还原风险的存在，其中，若L
d
大于或等于L
th
，则表示有还原风险。
[0012]另一方面，本专利技术提供一种控制细胞培养介质或细胞培养介质上清液中生物分子还原的方法，所述方法包括：
[0013](1)确定生物分子拟阈值还原水平L
th
；
[0014](2)测定所述细胞培养介质上清液的还原水平L
d
；和
[0015](3)比较L
d
与L
th
以判断还原风险的存在，其中，若L
d
大于或等于L
th
，则表示有还原风险；和，
[0016](4)在有还原风险时，向细胞培养介质或细胞培养介质上清液施用抗还原措施。
[0017]另一方面，本专利技术提供选自下组的一种或多种物质：用于检测还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADPH的试剂、二氯酚靛酚DCPIP、用于检测活细胞破碎率的试剂及其任意组合，在评估细胞培养介质上清液中生物分子还原风险中的用途。
[0018]另一方面，本专利技术提供选自下组的一种或多种物质：用于检测NADPH的试剂、DCPIP、用于检测活细胞破碎率的试剂，及其任意组合，在制造用于评估细胞培养介质上清液中生物分子还原风险的产品中的用途。
附图说明
[0019]下面结合附图对本专利技术作进一步说明，其中这些显示仅为了图示说明本专利技术的实施方案，而不是为了局限本专利技术的范围。
[0020]图1显示抗体分子A的细胞培养液在深层过滤过程中样品TrxR活性变化。
[0021]图2显示深层过滤澄清过程中TrxR活性的变化情况。
[0022]图3显示深层过滤澄清过程中由于细胞破裂导致的NADPH释放量情况。
[0023]图4显示通过NR SDS
‑
PAGE结果测量的还原情况。
[0024]图5显示不同细胞培养液上清和细胞破碎液中NADPH释放量。
[0025]图6显示不同分子的细胞培养液，不同培养阶段破碎活细胞后的NADPH释放量(每106个细胞的释放量)。
[0026]图7显示分子A的不同阶段细胞释放NADPH的量。
具体实施方式
[0027]本申请中科技术语的含意与本领域技术人员的普遍理解一致，除非另做说明。本申请中，“一”或其与各种量词的组合既包括单数含意也包括复数含意，除非特别说明。本申请中，对于同一参数或变量，当给出多个数值、数值范围、或其组合予以说明时，相当于具体揭示了这些数值、范围端值以及由它们任意组合而成的数值范围。本申请中，任一数值不论是否带有“约”之类的修饰词，一律涵盖本领域技术人员能够理解的约略范围，例如正负10％、5％等。本文中，每一“实施方式”均同等地指代且涵盖了本申请各项方法和各项系统的实施方式。本申请中，任意实施方式中一项或多项技术特征可以与任何一个或多个其他
实施方式中的一项或多项技术特征自由组合，由此得到的实施方式同样属于本申请公开的内容。
[0028]一方面，本专利技术提供一种评估细胞培养介质上清液中生物分子还原风险的方法，所述方法包括：
[0029](1)确定生物分子拟阈值还原水平L
th
；
[0030](2)测定所述细胞培养介质上清液的还原水平L
d
；和
[0031](3)比较L
d
与L
th
以判断还原风险的存在，其中，若L
d
大于或等于L
th
，则表示有还原风险。
[0032]本文中，“生物分子”指自然存在于生物体中或能在生物体中发挥作用的分子。在一些实施方式中，生物分子是包含二硫键的生物分子。生物分子可包括，例如，蛋白质、碳水化合物、脂质、核酸、代谢产物、天然产物等。在一些实施方式中，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种评估细胞培养介质上清液中生物分子还原风险的方法，所述方法包括：(1)确定生物分子拟阈值还原水平L
th
；(2)测定所述细胞培养介质上清液的还原水平L
d
；和(3)比较L
d
与L
th
以判断还原风险的存在，其中，若L
d
大于或等于L
th
，则表示有还原风险。2.如权利要求1所述的方法，其中，确定生物分子拟阈值还原水平L
th
包括：建立梯度稀释还原水平；和，确定使所述生物分子发生还原的最低梯度稀释还原水平和未使所述生物分子发生还原的最高梯度稀释还原水平；其中，使所述生物分子发生还原的最低梯度稀释还原水平或未使所述生物分子发生还原的最高梯度稀释还原水平被作为所述拟还原阈值水平L
th
。3.如权利要求2所述的方法，其中，建立梯度稀释还原水平可包括：收集细胞；裂解细胞；获得细胞裂解上清液；和，梯度稀释细胞裂解上清液，建立不同梯度稀释还原水平。4.如权利要求3所述的方法，其中，确定使所述生物分子发生还原的最低梯度稀释还原水平和未使所述生物分子发生还原的最高梯度稀释还原水平包括：测试各梯度稀释细胞裂解上清液的还原水平；测试生物分子在各梯度稀释细胞裂解上清液中还原与否；和，确定使所述生物分子发生还原的最低梯度稀释还原水平和未使所述生物分子发生还原的最高梯度稀释还原水平。5.如权利要求1所述的方法，其中，还原水平由还原指示剂指示。6.如权利要求5所述的方法，其中，所述还原指示剂包括选自下组的那些：还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADPH、二氯酚靛酚DCPIP、活细胞破碎...

【专利技术属性】
技术研发人员：孟如杰，崔以晴，李雨桐，
申请(专利权)人：上海药明生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：