本发明专利技术属于生物大分子组装领域，涉及一种胶原膜制备方法，包括：首先，取短程取向的胶原微纤膜，沿着胶原膜的长度方向拉伸，使胶原膜内部的微纤维沿着受力方向进一步取向，形成高度取向的胶原材料；其次，将高度取向的胶原材料进行离子孵育，诱导内部微纤维结构重排，以形成具有D带特征的结晶态的大直径胶原纤维；最后，通过光交联、戊二醛交联或者京尼平或者多酚进行化学交联。本发明专利技术能够获得长程取向的胶原材料，外观、微观形貌、杨氏模量和晶型结构等特征均与天然肌腱高度相仿。本发明专利技术的制备方法操作简便，不需要复杂的仪器设备，能够快捷有效的制备与天然肌腱或者韧带高度相似的胶原膜材料。原膜材料。原膜材料。
【技术实现步骤摘要】
一种具有高度取向和结晶性胶原纤维结构的胶原膜及其制备方法
[0001]本专利技术属于生物大分子组装领域，涉及一种具有高度取向和结晶性胶原纤维结构的胶原膜制备技术，其所获得的的胶原膜和应用。
技术介绍
[0002]胶原是脊椎动物中最丰富的蛋白质之一。由于它具有低免疫源性，高生物相容性，能促进细胞增殖和伤口愈合等优点，已被广泛用于各类生物医用材料。胶原分子是一种三螺旋结构，在体内一些内源性信号的指导下，可以进行分级有序组装，即从三螺旋结构开始，经历胶原微纤、胶原原纤、胶原纤维等不同层次结构。胶原分子的特定层次结构决定了每个特定组织的独特属性。例如，在肌腱和韧带中，棒状胶原分子以晶体状的方式，通过不同的堆积模式进行自组装，在一定的方向上择优排列并形成共价交联，导致组织在该方向上表现出很好的承载性能。受控分子组装是自然界用于形成具有各向异性胶原纤维的细胞外基质的过程。
[0003]然而，胶原分子的体外可控组装仍然是下一代组织工程的主要挑战。胶原蛋白的体外组装受到温度、pH、离子强度、亲疏水相互作用的影响，由此，目前的胶原“凝胶”通常是由松散堆积的纤维组成的随机网络，导致力学强度很低。
[0004]有研究者利用电化学沉积技术EDP制备高度取向的工程化的胶原材料。其原理是对胶原的酸性溶液施加电场，驱动胶原分子向阴极区域电泳迁移，同时由于阴极上发生的电化学反应(通常是电解水反应)可升高阴极局部的溶液pH值，泳动到等电点区域的胶原被析出，而形成胶原凝胶。该过程可以帮助棒状的胶原分子产生一定的取向排列，表现出一定的各向异性。进一步经过离子孵育，材料内部胶原分子进行有序排列，产生一定程度的结晶。最后进行化学交联，其极限拉伸强度(约为30MPa)和拉伸模量(约为400MPa)与无规交联的胶原相比大大提高，能达到天然肌腱的一半。
[0005]但是，目前已报道技术的缺点之一是因为等电点区域通常位于电解液中的某个位置，不能不方便取材，也无法利用电极形状对胶原材料进行塑形(比如获得管状、不规则形状胶原材料)，二是其取向完全依赖电场，取向程度有限，因此力学不能接近天然肌腱。三是两个电极之间间距很小，一般1
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2mm，不方便操作(An electrochemical fabrication process for the assembly of anisotropically oriented collagen bundles，Biomaterials 29(2008)3278
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3288；Tenogenic Induction of Human MSCs by Anisotropically Aligned Collagen Biotextiles，Adv.Funct.Mater.2014,24,5762
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5770)。
技术实现思路
[0006]本专利技术要解决的技术问题是提供一种获得高度取向、结晶性胶原纤维组成的胶原材料的制备方法。
[0007]为了解决上述技术问题，本专利技术采用改进EDP组装
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机械拉伸
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离子孵育
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化学交联四步骤，获得长程取向、晶态胶原纤维材料，力学性能接近天然肌腱。
[0008]本专利技术中的胶原膜制备方法，包括以下步骤：
[0009](1)机械拉伸：取短程取向的胶原微纤膜，沿着胶原膜的长度方向拉伸，使胶原膜内部的微纤维沿着受力方向进一步取向，形成高度取向的胶原材料；
[0010](2)离子孵育：将步骤(1)中高度取向的胶原材料置于0.05
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0.5M的PBS缓冲液进行离子孵育，孵育20
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40小时，诱导内部微纤维结构重排，以形成具有D带特征的结晶态的大直径胶原纤维；
[0011](3)化学交联：通过光交联、戊二醛交联或者京尼平交联。
[0012]可选的，步骤(1)中，将拉伸完毕的E
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Col胶原膜浸泡在乙醇中，暂时固定取向结构。拉伸的应变程度可以为0
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200％，不包括0。
[0013]可选的，步骤(2)中，离子孵育时将胶原膜材料的两端固定，保持胶原膜受到持续的外部作用力而不会收缩，例如，使用胶带将短程有序的胶原膜两端固定在培养皿或者其他可以存放液体的容器中。孵育时间为24
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36小时。孵育温度使用室温15
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26℃。
[0014]本专利技术中，PBS是指磷酸缓冲液，可以根据本领域的常规技术获得，例如可以采用以下配方(8g氯化钠，0.2g氯化钾，2.90g十二水磷酸二氢钠和0.2g磷酸二氢钾充分溶解于1000ml水中)。盐溶液浓度太高或者太低都会影响胶原膜纤维直径增加的速度，可选的，盐溶液的浓度为0.05
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1.0M，单位是摩尔/升。也可以根据需要使用浓度为0.1
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0.8M，较好的0.2
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0.5M的盐溶液。
[0015]可选的，所述光交联是指，将步骤(2)所得到的高度取向且结晶的胶原膜浸泡在0.2
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3.0mg/ml的核黄素溶液中，在紫外光照射下交联1
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3天。核黄素溶液以90％v/v乙醇
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水为溶剂，浓度为0.5
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2.0mg/ml，交联时间为20
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40小时。
[0016]可选的，所述戊二醛交联是指，将步骤(2)处理所得到的高度取向且结晶的胶原膜浸泡在0.1％
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1％(体积百分比)的戊二醛溶液里，交联10分钟
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2小时；随后去除胶原膜中残留的戊二醛组分。戊二醛溶液以0.5％w/v、90％v/v乙醇
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水为溶剂，交联时间为30
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50分钟。
[0017]可选的，所述京尼平交联是指，将步骤(2)处理所得到的高度取向、且结晶的胶原膜浸泡在质量百分比为0.2
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2.0％的京尼平溶液里，交联过夜；随后去除胶原膜中残留的京尼平组分。较好的，京尼平溶液的浓度为0.5
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1.0％，交联时间为8
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16小时。
[0018]可选的，所述多酚交联是指，将步骤(2)处理所得到的高度取向、且结晶的胶原膜浸泡在质量百分比为1.0
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2.0％，pH为8.5的原花青素溶液里，交联过夜；随后去除胶原膜中残留的多酚组分。较好的，原花青素溶液的浓度为1.5
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2.0％，交联时间为12小时。
[0019]可选的，去除胶原膜中残留的交联剂组分，例如京尼平或者戊二醛等，可以使用超纯水反复冲洗。例如，使用超纯水冲洗3
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5次。
[0020]本专利技术中，超纯水又称UP水，电阻率达到18MΩ*cm(25℃)的水，这种水中除了水分子外，几乎没有杂质，没有矿物质微量元素，更没有细菌、病毒、含氯二恶英等有机物。超纯水处理时，既将水中的导电本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种胶原膜制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)机械拉伸：取短程取向的胶原微纤膜，沿着胶原膜的长度方向拉伸，使胶原膜内部的微纤维沿着受力方向进一步取向，形成高度取向的胶原材料；(2)离子孵育：将步骤(1)中高度取向的胶原材料置于0.05
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1.0M的PBS缓冲液进行离子孵育，孵育18
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40小时，诱导内部微纤维结构重排，以形成具有D带特征的结晶态的大直径胶原纤维；(3)化学交联：通过光交联、戊二醛交联、京尼平或者多酚交联。2.如权利要求1所述的胶原膜制备方法，其特征在于，步骤(1)中，将拉伸完毕的E
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Col胶原膜浸泡在乙醇中，暂时固定取向结构；或者，拉伸的应变程度为0
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200％，不包括0。3.如权利要求1所述的胶原膜制备方法，其特征在于，步骤(2)中，离子孵育时将胶原膜材料的两端固定，保持胶原膜受到持续的外部作用力而不会收缩，然后浸泡在0.05
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0.5M的PBS缓冲液中；或者，孵育时间为24
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36小时。4.如权利要求1所述的胶原膜制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述光交联是指，将步骤(2)处理所得到的高度取向且结晶的胶原膜浸泡在0.2
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3.0mg/ml的核黄素溶液中，在紫外光照射下交联1
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3天；或者，所述戊二醛交联是指，将步骤(2)处理所得到的高度取向且结晶的胶原膜浸泡在0.1％
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1％的戊二醛溶液里，交联10分钟
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2小时；随后去除胶原膜中残留的戊二醛组分；或者，所述京尼平交联是指，将步骤(2)处理所得到的高度取向、且结晶的胶原膜浸泡在质量百分比为0.2
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2.0％的京尼平溶液里，交联过夜；随后去除胶原膜中残留的京尼平组分；或者，所述多酚交联是指，将步骤(2)处理所得到的高度取向、且结晶的胶原膜浸泡在质量百分比为0.1
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2.0％的原花青素、单宁酸或者没食子酸的水溶液里，交联过夜；随后去除胶原膜中残留的多酚组分。5.如权利要求4所述的胶原膜制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的光交联过程中，核...
【专利技术属性】
技术研发人员：屈雪，万浩然，雷淼，刘昌胜，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：
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