一种通过获取高发育潜能精子提高妊娠率的方法技术

本发明专利技术公开了一种通过获取高发育潜能精子提高妊娠率的方法，通过将卵母细胞与空透明带进行共孵育，然后对共孵育后的透明带进行酶消化，得到大量与透明带结合的精子，该精子进行ICSI注射，显著提高了小鼠的受精率、囊胚形成率和出生率。通过该方法的应用，一方面提高了透明带与精子的结合率，避免了透明带反应，阻止多精受精的现象，获得大量与透明带结合的精子。同时，通过消化酶消化透明带，将透明带内部结合的优质精子释放，用于ICSI注射，最终显著提高了小鼠出生率，以期改善人类辅助生殖患者的临床结局。者的临床结局。

【技术实现步骤摘要】
一种通过获取高发育潜能精子提高妊娠率的方法


[0001]本专利技术涉及辅助生殖
，尤其涉及一种通过获取高发育潜能精子提高妊娠率的方法。

技术介绍

[0002]卵胞浆内单精子注射(ICSI)技术是一种利用显微操作将单个精子注射到卵胞浆内，卵母细胞受精后，经体外培养形成早期胚胎，再选择优质胚胎移植到母体子宫内着床发育的一种辅助生殖技术。ICSI技术的应用，大大降低了辅助生殖所需精子的浓度、活动力和形态学标准，为众多不孕不育的夫妇带来了生育可能。多国家多中心的调查数据显示，ICSI在辅助生育中的使用率已由原来的39.6％上升到58.9％。目前，有些国家ICSI的使用率甚至已经达到了70％
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80％(Simopoulou M,et al.Improving ICSI:A reviewfrom the spermatozoon perspective.Syst Biol Reprod Med,2016,62:359
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371)。
[0003]但是，正常生殖过程中，能与卵母细胞进行受精的精子必须具有各种生理学功能并且通过重重障碍，例如穿过卵细胞透明带，才能发育形成受精卵。然而ICSI技术绕过了正常受精的绝大部分步骤，例如精子与透明带结合的顶体反应，人为选择形态正常的精子注射进入了卵母细胞。目前，传统的精子质量评价方式主要关注精子的形态和活率，精液样本主要经过直接洗涤法、密度梯度离心法或上游法等处理，然后将适量精子加入到聚乙烯吡咯烷酮溶液中，经显微镜下观察，从中选择形态正常(头部呈卵圆形，长4.0
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5.5μm，宽1μm；顶体占整个头部的40％
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70％；颈部、中段或尾部无异常)、活动力良好(前向运动)的精子注射到卵细胞胞浆中。但上游法和密度梯度离心法分别基于精子迁移和精子沉淀作用来筛选精子，无法满足精子其他特质的筛选，如精子DNA的完整性、精子膜的成熟度、精子凋亡和精子超微结构等，而精子这些特质的缺陷往往是导致不育的关键因素。因此，目前很多研究从提高辅助生殖的安全性和成功率出发，寻找更好的精子优选方法，把关注点放在精子成熟度和功能上，其中用透明带结合精子进行ICSI注射是目前优质精子的筛选热点方法。
[0004]人类卵母细胞被透明带(ZP)层包裹，在有生育能力男性的射精精液中，尽管平均每次射精包含1
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2亿个可活动的精子，但只有大约14％的可活动的精子能够在体外结合到人类的ZP，而低生育力男性人群，可以与透明带结合的活动精子甚至更少，平均为4.3％。因此，在自然受精过程中，只有结构健全的精子才能完成整个过程，因为精子必须有一个完整的顶体来结合ZP并出发顶体胞外作用。近年来许多研究表明(Braga et al.)认为结合ZP的能力可能是鉴定精子发育潜能的较佳方法，采用卵母细胞透明带上粘附的精子进行ICSI注射可以提高所形成胚胎的发育潜能，移植后提高妊娠率。其具体做法为用失去受精潜能的不成熟卵子的ZP去筛选高质量的精子，然后，用注射针管吸取透明带表面的精子进行ICSI注射，这样尽可能模拟自然选择的过程，弥补常规ICSI技术绕过顶体反应、精卵结合等自然受精生理过程的短板，以期提高ICSI的成功率。
[0005]但是，由于精子粘附在卵母细胞透明带上是精子头部蛋白与透明带蛋白相互作用的结果，将粘附的精子从透明带上取下来相当困难，所以采用卵母细胞透明带上粘附的精
子进行ICSI注射所用的精子为透明带表面粘附的精子，用显微注射针吸取透明带表面的精子，但透明带内部通过ZP糖蛋白中的寡糖和精子表面蛋白质相互作用，实现精卵识别并诱发顶体反应的精子，几乎不可能通过显微注射针收集用于ICSI注射。并且在卵母细胞存在的情况下，容易发生透明带反应，当透明带硬化，阻止精子与透明带结合，进一步减少了用于ICSI注射的精子数量，而精子中DNA正常的精子比例与精子的数量有显著的相关性，因此，如何获得大量，优质的精子用于ICSI注射，是本领域技术人员急需要解决的难题。由于卵母细胞资源有限，优选精子是改善ICSI技术的突破口之一。优选精子的关注点不仅要考虑精子的活力和形态，更应把是否筛选掉遗传物质异常的精子作为精子评估的重点。未来急需寻求一种简单、客观、高效和安全的精子优选方法，以期改善辅助生殖技术患者的临床结局。
[0006]由于小鼠的遗传信息日益丰富，小鼠卵子及胚胎易于体外培养，所以小鼠卵子是一项非常理想的研究模型。ICSI技术可以应用在小鼠和人类上并获得正常的后代，而这种技术在其他物种里鲜有成功。事实上是，由于小鼠和人类的顶体较小，虽然ICSI时会带入包含强大水解酶的顶体，但不会影响到卵母细胞。与之相比，仓鼠就不行，由于该物种的顶体巨大，ICSI势必会导致卵母细胞的死亡(Pase et al,Reprod Biomed Online,2009,19:802
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807)。
[0007]然而，目前，还未见用空透明带与精子共孵育，然后收集空透明带内部精子进行ICSI注射的相关报道。

技术实现思路

[0008]为了解决上述技术问题，本专利技术主要目的是提供了一种通过获取高发育潜能精子提高妊娠率的方法，旨在通过卵母细胞透明带对精子的筛选，获得大量、高质量的精子，提高卵胞浆内单精子注射(ICSI)的临床结局。
[0009]为了实现本专利技术目的，本专利技术的技术方案如下：
[0010]一种通过获取高发育潜能精子提高妊娠率的方法，将去掉卵母细胞质的空透明带与精子共孵育，得到共孵育透明带，将共孵育透明带进行酶消化，得到消化后精子，将消化后精子进行卵胞浆内单精子注射。
[0011]所述去掉卵母细胞质的空透明带的制备方法为：将卵母细胞放入非渗透性保护剂，待卵母细胞的细胞质收缩后，用吸取针将细胞质吸出，获得孔透明带。理论上将应该所有非渗透性保护剂都是可以的，蔗糖最为常用，而且蔗糖浓度太低的卵母细胞的细胞质收缩时间太长，浓度太高卵母细胞就会停留在蔗糖液滴的上层不易操作，所以在本专利技术实施例中使用的非渗透性保护剂为蔗糖，浓度为0.1
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1M，优选0.2M，平衡时间为30秒。
[0012]所述共孵育时间为2
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3小时，共孵育溶剂为G
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IVF PLUS液。其中G
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IVF液为瑞典Vitrolife辅助生殖IVF
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洗精受精液，型号为G
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IVF PLUS/60mL
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10136。本专利技术的专利技术人发现，共孵育时间太短，不利于精子和透明带的结合，但共孵育时间太长会有过多的死亡精子，这样可能会产生活性氧，活性氧会进一步引起透明带的硬化，进而阻止精子与透明带的结合，因此，专利技术人发现共孵育2
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3小时，就足以达到本研究中长时间共孵育所达到的着床率和妊娠率。
[0013]所述精子，原则上所有哺乳动物的精子都可以应用该方法，但由于鼠的精子或人
的精子的顶体大小相似，优选，鼠的精子或人的精子。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种通过获取高发育潜能精子提高妊娠率的方法，其特征在于，将去掉卵母细胞质的空透明带与精子共孵育，得到共孵育透明带，将共孵育透明带进行酶消化，得到消化后精子，将消化后精子进行卵胞浆内单精子注射。2.如权利要求1所述的通过获取高发育潜能精子提高妊娠率的方法，其特征在于，所述去掉卵母细胞质的空透明带的制备方法为：将卵母细胞放入非渗透性保护剂，平衡，待卵母细胞的细胞质收缩后，用吸取针将细胞质吸出，获得空透明带。3.如权利要求2所述的通过获取高发育潜能精子提高妊娠率的方法，其特征在于，所述非渗透性保护剂为蔗糖，浓度为0.1
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1M，平衡时间为30秒。4.如权利要求2所述的通过获取高发育潜能精子提高妊娠率的方法，其特征在于，所述用吸取针将细胞质吸出，在显微操作仪下操作，在显微操作仪上装好固定针和吸取针，用固定针吸住细胞质收缩的卵母细胞，通过激光装置在卵母细胞的透明带上打孔，将吸取针通过孔穿入透明带，将卵母细胞的...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭磊，王传杰，
申请(专利权)人：广东省第二人民医院广东省卫生应急医院，
类型：发明
国别省市：