一种基于Cas13a系统的检测外泌体的生物传感器技术方案

本发明专利技术属于生物检测技术领域，提供了一种基于Cas13a系统的检测外泌体的生物传感器，包括：核苷酸序列如SEQ NO:1

【技术实现步骤摘要】
一种基于Cas13a系统的检测外泌体的生物传感器


[0001]本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种基于Cas13a系统的检测外泌体的生物传感器。

技术介绍

[0002]外泌体是指包含了复杂RNA和蛋白质的小膜泡(30
‑
150nm)，现今，其特指直径在40
‑
100nm的盘状囊泡。1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现， 1987年Johnstone将其命名为“exosome”。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。外泌体广泛存在于各种体液中，可携带脂类、蛋白质、信使RNAs、非编码RNAs等多种重要的生物功能分子，能够参与细胞间物质交换和信息交流。
[0003]外泌体在医学上具有广阔的应用前景，可以作为外伤或者美容的目的进行应用，其效果依赖于外泌体含量的多少。目前报道的检测外泌体的方法包括质谱和免疫分析，包括western blot和酶联免疫试验（ELISA），但是这些方法需要繁琐的样品前处理，因此限制了它们快速检测外泌体的应用。因此急需一种快速、准确、简便、微量的分析方法，以对外泌体进行检测。近几年，DNA生物传感检测技术以及Cas系统凭借其高灵敏性和特异性得到广泛的关注与应用。其中，荧光发光技术的基础理论研究日益成熟，它在生物学、医学等领域所扮演的角色越来越重要。相对于其他检测手段，荧光技术具有显著的优势，灵敏度高、特异性强、价格低廉。
专利技术内容
[0004]针对现有技术中的问题，本专利技术提供一种检测基于Cas13a系统的检测外泌体的生物传感器，检测速度快、操作简单、价格低廉、检测限低、特异性高。
[0005]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案。
[0006]一种基于Cas13a系统的检测外泌体的生物传感器，包括：核苷酸序列如SEQ NO: 1
‑
7所示的EpCAM
‑
Apt，P1探针，发卡探针H1、H2、H3、H4，Reporter探针和T7 RNA polymerase，Cas13a/crRNA；所述Reporter探针的5
’
端和3
’
端分别连接荧光报告基团和荧光猝灭基团；所述crRNA的核苷酸序列SEQ NO: 8所示。
[0007]优选地，所述EpCAM
‑
Apt和P1探针以Apt
‑
P1探针代替，所述Apt
‑
P1探针为EpCAM
‑
Apt和P1探针杂交获得的双链。
[0008]一种包含上述生物传感器的检测外泌体的试剂盒。
[0009]所述试剂盒还包括外泌体标准品、缓冲溶液。
[0010]一种采用上述生物传感器或试剂盒对外泌体进行检测的方法，包括以下步骤：（1）人工合成EpCAM
‑
Apt，P1探针，发卡探针H1、H2、H3、H4，Reporter探针和crRNA；并获得Apt
‑
P1探针和Cas13a/crRNA；
（2）将待测样品或外泌体标准品与Apt
‑
P1探针在缓冲溶液中混合，反应30 min；然后加入H1、H2、H3、H4反应30
‑
130 min；然后加入T7 RNA polymerase和Cas13a/crRNA于37 ℃反应30 min；然后加入Reporter探针，反应60min；设置激发波长为485nm，发射波长为520nm，检测荧光信号；（3）根据外泌体标准品的荧光信号计算待测样品中外泌体含量。
[0011]本专利技术的检测原理如下：生物传感器用到以下序列：EpCAM
‑
Apt：CACTACAGAGGTTGCGTCTGTCCCACGTTGTCATGGGGGGTTGGCCTGP1：TCTCCAACGGTCTGTCCCTGCAACAGTH1：GGTTGCCAGACAGGGTAGACTACCGTAGCCCTGTCTGGACCACCCCAAAAAUGAAGGGGACUAAAACCUACCUGCACUGUAAGCACUUUGH2：GTCTGTCCCATCTGATGGCATCGACTGCTACGGCTGCAGACAGACTCAAGH3：CTTGAGTCTGTCTGCAGCCGTAGCAGTGCTACGGTAGTCTACCCTGTCTGGACCACCCCAAAAAUGAAGGGGACUAAAACCUACCUGCACUGUAAGCACUUUGH4：GGTTGCCAGACAGGGCAGACTGGGTAGACTACCGTAGCReporter探针：FAM
‑
TTAAAATT
‑
BHQ1；crRNA：GACCACCCCAAAAAUGAAGGGGACUAAAACGUGGUAACCGUCCCCCUUGCEpCAM
‑
Apt和P1探针部分序列互补，可形成拱形探针Apt
‑
P1；当目标物存在时，目标物与Apt
‑
P1探针特异性结合，释放出P1，P1与H1暴露出来的部分互补，将H1打开，暴露出来的部分又与H2互补，将H2打开，同时暴露出末端H3互补，将H3打开，形成聚合物结构，发夹H4与聚合物末端互补，形成一个十字形聚合物结构的同时将P1替换下来，实现P1循环，通过HCR反应实现放大的效果；加入T7 RNA polymerase后，将切割十字形聚合物并释放出若干RNA，RNA和Cas13a/crRNA结合，激发Cas13a的切割活性；加入Reporter探针后，激活的Cas13a切割Reporter探针，导致猝灭基团和荧光基团分离，产生荧光，从而通过测量荧光强度来定量检测外泌体含量。
[0012]本专利技术具有以下优点：本专利技术的生物传感器利用核酸适配体与外泌体的特异性结合实现了对目标物的高特异性检测；利用HCR反应，形成了十字形的聚合物结构，同时在P1的循环利用下，实现了指数放大，放大检测信号，提高了检测的灵敏度，实现对目标物外泌体的超灵敏检测；检测限可达到1 μg/mL，检测限低。该传感器的构建简单，有效避免了多步加入样品可能带来的
污染，以及繁琐的样品前处理过程，具有操作简单、反应速度快等优势；检测原理的主要过程均是在均相中实现的，提高了反应速度，降低了操作的复杂程度，实现了目标物的快速，简单，灵敏的检测；制作该生物传感器的工艺成本低，适用于产业化中低廉的要求；适用于医学上对外泌体的检测的实际要求。
附图说明
[0013]图1为本专利技术的原理图；图2为H1浓度优化检测结果图；图3为H2浓度优化检测结果图；图4为H3浓度优化检测结果图；图5为反应时间优化检测结果图；图6为外泌体浓度检测结果图。
具体实施方式
[0014]下面结合实施例和附图对本专利技术做进一步说明，但本专利技术不受下述实施例的限制。
[0015]实施例1H1
‑
H本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于Cas13a系统的检测外泌体的生物传感器，其特征在于，包括：核苷酸序列如SEQ NO: 1
‑
7所示的EpCAM
‑
Apt，P1探针，发卡探针H1、H2、H3、H4，Reporter探针和T7 RNA polymerase，Cas13a/crRNA；所述Reporter探针的5
’
端和3
’
端分别连接荧光报告基团和荧光猝灭基团；所述crRNA的核苷酸序列SEQ NO: 8所示。2.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述EpCAM
‑
Apt和P1探针以Apt
‑
P1探针代替，所述Apt
‑
P1探针为EpCAM
‑
Apt和P1探针杂交获得的双链。3.一种包含如权利要求1或2所述的生物传感器的检测外泌体的试剂盒。4.根据权利要求3所...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄加栋，李宗强，王玉，刘素，郭志强，朱志学，朱镜儒，姚玉颖，李倩茹，李静静，张清心，徐婉晴，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：