一种通过孔形成介导的直接易位方式进入细胞的透膜刷状聚合物的制备方法和应用技术

一种通过孔形成介导的直接易位方式进入细胞的透膜刷状聚合物的制备方法和应用。为解决进入细胞的药物分子被束缚在囊泡中无法发挥实际功能的问题，合成了富含精氨酸的透膜刷状聚合物PTn

【技术实现步骤摘要】
一种通过孔形成介导的直接易位方式进入细胞的透膜刷状聚合物的制备方法和应用


[0001]本专利技术属于高分子生物材料领域，涉及一种通过孔形成介导的直接易位方式进入细胞的新型富含精氨酸的透膜刷状聚合物的制备方法和应用。

技术介绍

[0002]药物分子的细胞内转导是药物投递系统中非常重要的一环。生物大分子或亲水药物的透膜递送仍然是一个重大挑战。一种高效的运输载体将从某个层面应对这一挑战。细胞透膜肽(cell penetrating peptides,CPPs)是一类阳离子短肽，可以有效地透过细胞膜并携带生物活性物质进入细胞。一般认为CPPs可以通过一种或多种途径进入细胞，大多数情况下，内吞是主要的摄取途径。通过内吞途径递送的局限性包括不可避免的内涵体/溶酶体的滞留和降解，这些局限性成为了降低细胞内递送效率的主要因素。另外，当内吞作用被抑制或浓度超过阈值时，CPPs可通过直接转导作用进入细胞。直接转导方式可以直接将药物分子递送至细胞质，避免内涵体/溶酶体滞留，从而使细胞内递送更高效。然而，随着药物剂量和浓度的增加而增加的毒性；以及由于全身稀释，静脉注射后CPPs到达靶细胞的实际浓度较低，这些因素均使通过直接转导机制的递送途径变得难以实现。因此，开发能够通过直接转导方式进入细胞的载体是非常迫切的。
[0003]通过直接转导的细胞内化涉及到能量和温度非依赖性的细胞膜的失稳，现有报道的膜失稳机制包括反胶束模型、孔形成模型和“地毯”模型。近些年来，孔形成介导的直接转导机制以快速高效的穿膜优势成为了研究热点，具体包括五个主要步骤，包括细胞膜外侧多肽的吸附与聚集引起膜的局部大扰动、磷脂双分子层厚度的减小、精氨酸和远端磷酸基团之间的强相互作用、瞬时孔的形成，以及多肽在孔表面扩散进入细胞内部。人们在探索孔形成的影响因素方面做出了许多努力，研究表明肽处于捆绑状态时形成水孔的临界浓度低于单一肽，且捆绑数与摄取效率呈线性相关。精氨酸侧链的长度对于胍基到达远端磷酸基团非常重要。了解影响孔形成的因素不仅有助于阐明孔形成机制，而且有助于为合理设计直接易位载体提供新的思路。

技术实现思路

[0004]本专利技术目的是解决现有递送载体会使进入细胞的药物分子被束缚在囊泡中无法发挥实际功能甚至被降解而失活的问题，提供一种通过孔形成介导的直接易位方式进入细胞的新型富含精氨酸的透膜刷状聚合物的制备方法和应用。
[0005]本专利技术的技术方案
[0006]一种通过孔形成介导的直接易位方式进入细胞的透膜刷状聚合物，所述透膜刷状聚合物为降冰片烯聚合骨架，侧链包含两个精氨酸残基短肽R2或四个精氨酸残基短肽R4，和一个柔性己酸连接臂C6或非柔性丙酸连接臂C2，化学式为PTn
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R2
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C6，或PTn
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R2
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C2或PTn
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R4
‑
C6，n为聚合度，为小于等于100的任何自然数(优选10，15和25)；其中短肽R2或R4羧
基端为酰胺键；R2或R4氨基端的氨基和C6或C2的羧基通过酰胺键连接；聚合物为均聚物，只含有一种侧链结构。
[0007]本专利技术同时提供了一种通过孔形成介导的直接易位方式进入细胞的透膜刷状聚合物的制备方法，制备流程如图1所示，包括如下步骤：
[0008]1)多肽序列R2和R4的合成；
[0009]1.1)多肽序列R2的合成；
[0010]根据R2的氨基酸序列，Ac
‑
Arg
‑
Arg
‑
NH2，以Rink
‑
酰胺树脂为固相载体，以HBTU
‑
HOBt为缩合剂，采取标准Fmoc策略，固相多肽合成方法合成目标多肽序列NH2‑
Arg
‑
Arg
‑
COOH，简称为R2；
[0011]1.2)多肽序列R4的合成；
[0012]根据R4的氨基酸序列，Ac
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Arg
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Arg
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Arg
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Arg
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NH2，以Rink
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酰胺树脂为固相载体，以HBTU
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HOBT为缩合剂，采取标准Fmoc策略，固相多肽合成方法合成目标多肽序列NH2‑
Arg
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Arg
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Arg
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Arg
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COOH，简称为R4；
[0013]2)富含精氨酸多肽单体的合成；
[0014]2.1)NorAha
‑
R2多肽单体的合成；
[0015]将三倍物质的量的降冰片烯基团N
‑
(6
‑
己酸)
‑5‑
降冰片烯
‑
外
‑
2,3
‑
二甲酰亚胺通过羧基和氨基的缩合反应连接到步骤1.1)合成的多肽R2氨基端得到连接在树脂上的多肽单体NorAha
‑
R2；
[0016]多肽单体与树脂的切割：在反应器中用无水乙醚冲洗树脂三次，使树脂尽可能干燥，称重后将树脂转移到圆底烧瓶(规格为250毫升)中，冰浴条件下加入切割液(水/三氟乙酸/间甲酚/苯甲醚/＝0.5％/82.5％/5％/5％，体积比)，搅拌15
‑
30min，于室温下继续搅拌2.5
‑
4h；按切割液与乙醚1:20的体积比例加入无水乙醚，室温下剧烈搅拌0.5
‑
1.5h，停止搅拌后静置使沉淀能够充分析出，无水乙醚多次洗涤沉淀，将沉淀充分溶解于去离子水中，G4砂芯漏斗抽滤并收集滤液，所得粗肽溶液于冷冻干燥机进行抽干处理，最终得到干燥固体多肽单体；经RP
‑
HPLC纯化，可得纯NorAha
‑
R2多肽单体；
[0017]2.2)NorGly
‑
R2多肽单体的合成；
[0018]将三倍物质的量的N
‑
(甘氨酸)
‑5‑
降冰片烯
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外
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2,3
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二甲酰亚胺通过羧基和氨基的缩合反应连接到步骤1.1)合成的多肽R2的N端得到连接在树脂上的多肽单体NorGly
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R2；
[0019]多肽单体与树脂的切割：在反应器中用无水乙醚冲洗树脂三次，使树脂尽可能干燥。称重后将树脂转移到圆底烧瓶(规格为250毫升)中，冰浴条件下加入同步骤2.1)中的切割液，冰浴条件下搅拌15
‑
30min，于室温下继续搅拌2.5
‑
4h；按切割液与乙醚1:20的体积比例加入无水乙醚，室温下剧烈搅拌0.5
‑
1.5h，停止搅拌后静置使沉淀能够充分析出，无水乙醚多次洗涤沉淀。将粉末状沉淀充分溶解于去离子水中，G4砂芯漏斗抽滤并收集滤液，所得粗肽溶液冷冻干燥本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种通过孔形成介导的直接易位方式进入细胞的透膜刷状聚合物，所述透膜刷状聚合物为降冰片烯聚合骨架，侧链包含两个精氨酸残基短肽R2或四个精氨酸残基短肽R4，和一个柔性己酸连接臂C6或非柔性丙酸连接臂C2，化学式为PTn
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R2
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C6，或PTn
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R2
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C2，或PTn
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R4
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C6；其中聚合度n为小于等于100的任何自然数，短肽R2或R4羧基端为酰胺键；R2或R4氨基端氨基和C6或C2的羧基通过酰胺键连接；聚合物为均聚物，只含有一种侧链结构。2.根据权利要求1所述的通过孔形成介导的直接易位方式进入细胞的透膜刷状聚合物，其特征在于，所述聚合度n的取值为10，15和25。3.一种权利要求1所述的通过孔形成介导的直接易位方式进入细胞的透膜刷状聚合物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：1)多肽序列R2和R4的合成；1.1)多肽序列R2的合成；根据R2的氨基酸序列，Ac
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Arg
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NH2，以Rink
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酰胺树脂为固相载体，以HBTU
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HOBt为缩合剂，采取标准Fmoc策略，固相多肽合成方法合成目标多肽序列NH2‑
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COOH，简称为R2；1.2)多肽序列R4的合成；根据R4的氨基酸序列，Ac
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NH2，以Rink
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酰胺树脂为固相载体，以HBTU
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HOBt为缩合剂，采取标准Fmoc策略，固相多肽合成方法合成目标多肽序列NH2‑
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COOH，简称为R4；2)富含精氨酸多肽单体的合成；2.1)NorAha
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R2多肽单体的合成；将三倍物质的量的降冰片烯基团N
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(6
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己酸)
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降冰片烯
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外
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2,3
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二甲酰亚胺通过羧基和氨基的缩合反应连接到步骤1.1)合成的多肽R2氨基端得到连接在树脂上的多肽单体NorAha
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R2；多肽单体与树脂的切割：将称重后的树脂转移到圆底烧瓶中，冰浴条件下加入切割液，冰浴条件下搅拌15
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30min，于室温下继续搅拌2.5
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4h，所述切割液为按体积比水:三氟乙酸:间甲酚:苯甲醚＝0.5％:82.5％:5％:5％的混合液；按切割液与乙醚为1:20的体积比例加入无水乙醚，室温下剧烈搅拌0.5
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1.5h，停止搅拌后静置使沉淀能够充分析出，无水乙醚洗涤沉淀，将沉淀充分溶解于去离子水中，G4砂芯漏斗抽滤并收集滤液，所得粗肽溶液冷冻干燥处理，最终得到干燥固体多肽单体；经RP
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HPLC纯化，可得纯NorAha
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R2多肽单体；2.2)NorGly
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R2多肽单体的合成；将三倍物质的量的N
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(甘氨酸)
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降冰片烯
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外
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2,3
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二甲酰亚胺通过羧基和氨基的缩合反应连接到步骤1.1)合成的R2的N端得到连接在树脂上的多肽单体NorGly
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R2；多肽单体与树脂的切割：将称重后的树脂转移到圆底烧瓶中，冰浴条件下加入同步骤2.1)中的切割液，冰浴条件下搅拌15
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30min，于室温下继续搅拌2.5
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4h；按切割液与乙醚为1:20的体积比加入无水乙醚，室温下剧烈搅拌0.5
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1.5h，停止搅拌后静置使沉淀能够充分析出，无水乙醚洗涤沉淀；将粉末状沉淀充分溶解于去离子水中，G4砂芯漏斗抽滤并收集滤液，所得粗肽...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘阳，康子瑶，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：