适合腺病毒载体增殖的MDCK-KOslc35b2细胞系及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种适合腺病毒载体增殖的MDCK

【技术实现步骤摘要】
适合腺病毒载体增殖的MDCK
‑
KOslc35b2细胞系及其应用


[0001]本专利技术涉及分子生物学，具体涉及一种适合腺病毒载体增殖的MDCK
‑
KOslc35b2细胞系及其应用。

技术介绍

[0002]重组腺病毒载体是一种复制缺陷的腺病毒载体系统，可以承载外源基因，作为基因递送载体应用于疫苗研发。人腺病毒载体5型(Adenovirus5,Ad5)，其基因组是36Kb长的线性双链DNA，是临床疫苗最常用的腺病毒载体。近年来，腺病毒载体已广泛应用到埃博拉病毒、人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)、流感病毒、恶性疟原虫、结核分枝杆菌、丙型肝炎病毒等的候选疫苗研究。我国自主研发的基于人类腺病毒5型病毒载体的重组新型冠状病毒疫苗Ad5
‑
nCoV已临床应用于2019冠状病毒病(Coronavirus disease 2019,COVID
‑
19)疫病预防。
[0003]但机体存在的针对腺病毒载体的预存免疫一直阻碍着该类疫苗的研发和应用。犬腺病毒(canine adenovirus，CAV)是哺乳动物腺病毒属中致病力最强的病毒之一，分为犬腺病毒
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1(CAV
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1)和犬腺病毒
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2(CAV
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2)两型。犬腺病毒CAV
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2具有高度种属特异性，能感染进入人体但不能复制，在一定程度上避免人体预存免疫问题，展示了很好的腺病毒载体疫苗载体研发前景。同时CAV
‑
2还可作为口服疫苗载体有望解决野生动物免疫的难题。
[0004]由此可见，CAV
‑
2不仅是一种重要的人用基因递送的候选载体，而且是非常有价值的动物用疫苗载体工具。因此，提高CAV
‑
2病毒增殖滴度以降低疫苗成本的研究，对于重组腺病毒载体疫苗的研制尤为重要。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种适合腺病毒载体载体增殖的MDCK
‑
KOslc35b2细胞系及其应用，本专利技术利用CRISPR技术特异靶向性和高效切割率的特点对细胞的slc35b2基因进行靶向突变，达到基因功能失活的效果；因其在基因组水平对细胞进行改造，双染色体均发生突变，得到的slc35b2基因功能失活的、可稳定遗传的细胞系。且该细胞系具有提高腺病毒载体增殖的效果，有利于提高腺病毒载体滴度从而达到提高临床腺病毒载体疫苗生产效率等作用。
[0006]为实现上述目的，本专利技术所设计一种适合腺病毒载体增殖的MDCK
‑
KOslc35b2细胞系，所述细胞系的全基因组中slc35b2基因位于第12号染色体，所述细胞系的全基因组中，第12号的一个染色体上的slc35b2基因的第二段外显子基因序列(第二段外显子基因序列如SEQ IDNO.1所示)上连续缺少七个碱基TCTGACT，所述七个碱基TCTGACT位于SLC35B2基因序列(SLC35B2基因序列登入于NCBI，其登入号为Gene ID:481819)上的12857085
‑
12857093的位点间；
[0007]第12号的另一个染色体上的slc35b2基因的第二段外显子基因序列上连续缺少十七个碱基GGTCCCTCTGACTTCGC，所述十七个碱基GGTCCCTCTGACTTCGC位于SLC35B2基因序列
上的12857081
‑
12857099的位点间(该MDCK
‑
KOslc35b2细胞系通过SLC35B2基因缺少，造成该基因不能正确表达，从而达到敲除SLC35B2基因的目的)。
[0008]本专利技术还提供了一种上述适合腺病毒载体增殖的MDCK
‑
KOslc35b2细胞系的构建方法，包括以下步骤：
[0009]1)稳定表达Cas9蛋白的MDCK细胞系的构建；
[0010]2)靶向slc35b2第二外显子的突变质粒lentiGuide
‑
sgRNA slc35b2的构建；
[0011]3)靶向slc35b2的lentiGuide
‑
sgRNA slc35b2慢病毒生产；
[0012]4)包含slc35b2基因突变的混合细胞的构建
[0013]5)slc35b2功能失活的MDCK
‑
KOslc35b2细胞系的筛选。
[0014]进一步地，所述步骤1)中，稳定表达Cas9蛋白的MDCK细胞系的构建方法如下：
[0015]a.将293FT细胞铺至6孔板中，将慢病毒包装的质粒pMD2.G、psPAX2、lentiCas9
‑
Blast共转染293FT细胞(转染过程中，pMD2.G能形成病毒囊膜、psPAX2能表达gag和pol进行病毒包装、lentiCas9
‑
Blast质粒不仅含有被包装进入假病毒粒子包装信号、长末端重复序列，还含有Cas9蛋白及Blasticidin抗性筛选基因)，转染后收集细胞培养，离心，取上清即为含有慢病毒粒子的溶液；
[0016]b.将MDCK细胞铺至12孔板中，加入不同浓度的Blasticidin抗生素，筛选出在3天时间内能够杀死全部细胞的最低浓度，并将此浓度定为后期筛选MDCK细胞的敏感浓度；
[0017]c.将MDCK铺至6孔板中，待其贴壁，以培养基和慢病毒悬液体积比1：1加入6孔板中，细胞培养，定期换新鲜完全培养基，并按照MDCK细胞的敏感浓度，加入Blasticidin抗生素筛选阳性细胞，按照1细胞/孔，铺入96孔板，选择在Blasticidin抗生素敏感浓度下生长快速的细胞进行扩大，即为稳定表达Cas9的MDCK细胞系。
[0018]再进一步地，所述步骤2)中，靶向slc35b2第二外显子的突变质粒lentiGuide
‑
sgRNAslc35b2的构建方法如下：
[0019]a.根据位于犬第12号染色体(第12号染色体的序列登入于NCBI，其登入号为Gene ID:481819)上的序列(即slc35b2的第二个外显子序列)，设计了靶向突变的sgRNA序列，为GCTCAGACCGCGAAGTCAGA；
[0020]b.在靶向突变的sgRNA序列的两端补充BsmBI酶切后的粘性末端，合成序列如下：
[0021]d
‑
slc35b2
‑
sgRNA
‑
F:5
’‑
CACCGCTCAGACCGCGAAGTCAGA
‑3’
，
[0022]d
‑
slc35b2
‑
sgRNA
‑
R:5
’‑
AAACTCTGACTTCGCGGTCTGAGC
‑3’<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种适合腺病毒载体增殖的MDCK
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KOslc35b2细胞系，其特征在于：所述细胞系的全基因组中slc35b2基因位于第12号染色体，所述细胞系的全基因组中，第12号的一个染色体上的slc35b2基因的第二段外显子基因序列上连续缺少七个碱基TCTGACT，所述七个碱基TCTGACT位于SLC35B2基因序列上的12857085
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12857093的位点间；第12号的另一个染色体上的slc35b2基因的第二段外显子基因序列上连续缺少十七个碱基GGTCCCTCTGACTTCGC，所述十七个碱基GGTCCCTCTGACTTCGC位于SLC35B2基因序列上的12857081
‑
12857099的位点间。2.一种权利要求1所述适合腺病毒载体增殖的MDCK
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KOslc35b2细胞系的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：1)稳定表达Cas9蛋白的MDCK细胞系的构建；2)靶向slc35b2第二外显子的突变质粒lentiGuide
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sgRNA slc35b2的构建；3)靶向slc35b2的lentiGuide
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sgRNA slc35b2慢病毒生产；4)包含slc35b2基因突变的混合细胞的构建；5)slc35b2功能失活的MDCK
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KOslc35b2细胞系的筛选。3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于：所述步骤1)中，稳定表达Cas9蛋白的MDCK细胞系的构建方法如下：a.将293FT细胞铺至6孔板中，将慢病毒包装的质粒pMD2.G、psPAX2、lentiCas9
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Blast共转染293FT细胞，转染后收集细胞培养，离心，取上清即为含有慢病毒粒子的溶液；b.将MDCK细胞铺至12孔板中，加入不同浓度的Blasticidin抗生素，筛选出在3天时间内能够杀死全部细胞的最低浓度，并将此浓度定为后期筛选MDCK细胞的敏感浓度；c.将MDCK铺至6孔板中，待其贴壁，以培养基和慢病毒悬液体积比1：1加入6孔板中，细胞培养，定期换新鲜完全培养基，并按照MDCK细胞的敏感浓度，加入Blasticidin抗生素筛选阳性细胞，按照1细胞/孔，铺入96孔板，选择在Blasticidin抗生素敏感浓度下生长快速的细胞进行扩大，即为稳定表达Cas9的MDCK细胞系。4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于：所述步骤2)中，靶向slc35b2第二外显子的突变质粒lentiGuide
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sgRNAslc35b2的构建方法如下：a.根据位于犬第12号染色体上的序列，设计了靶向突变的sgRNA序列，为GCTCAGACCGCGAAGTCAGA；b.在靶向突变的sgRNA序列的两端补充BsmBI酶切后的粘性末端，合成序列如下：d
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slc35b2
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sgRNA
‑
F:5
’‑
CACCGCTCAGACCGCGAAGTCAGA
‑3’
，d
‑
slc35b...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩丽，王晓萍，张安定，叶贵珊，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：