特异性结合MAGE-A的抗原结合蛋白制造技术

本发明专利技术涉及特异性结合色素瘤相关抗原A(MAGE

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】特异性结合MAGE
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A的抗原结合蛋白
[0001]本专利技术涉及特异性结合色素瘤相关抗原A(MAGE
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A)蛋白来源抗原的抗原结合蛋白。本专利技术特别提出了与MAGE
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A抗原肽特异性结合的抗原结合蛋白，所述MAGE
‑
A抗原肽包含SEQ ID NO:1或由SEQ ID NO:1组成且与主要组织相容性(MHC)蛋白形成复合体。特别地，本专利技术的抗原结合蛋白含有与所述MAGE
‑
A肽/MHC复合体特异性结合的新型改造T细胞受体(TCR)的互补决定区(CDR)。本专利技术的抗原结合蛋白可用于诊断、治疗和预防表达MAGE
‑
A的癌性疾病。还提出了编码本专利技术抗原结合蛋白的核酸、包含这些核酸的载体、表达抗原结合蛋白的重组细胞以及包含本专利技术抗原结合蛋白的药物组合物。
[0002]专利技术背景
[0003]氨基酸序列“KVLEHVVRV”(SEQ ID NO:1)的MAGE
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A肿瘤抗原(也称为MAG
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003肽)是MAGE
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A4(氨基酸286
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294)和MAGE
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A8(氨基酸288
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296)的一个HLA
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A*02:01限制性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位(Zheng
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Cai J.et al.Clin Dev.Immunol.2010,567594)。MAGE
‑r/>A4和MAGE
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A8都是蛋白，并且是MAGE
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A基因家族成员。尽管MAGE
‑
A8和
‑
A4可能在胚胎发育、肿瘤转化或肿瘤进展方面发挥作用，但它们的功能目前尚不清楚。这些蛋白已确定了多种选择性剪接变体。根据SEQ ID NO:1的MAGE
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A抗原属于在肿瘤中表达但在睾丸和胎盘之外的正常组织中不表达的癌症/睾丸(CT)抗原。MAGE
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A4蛋白和mRNA表达等与各种癌症的发生和预后有关。主要组织相容性复合体(MHC)分子提呈的肽例如MAGE
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A(特别是MAGE
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A4和/或MAGE
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A8)衍生的肽“KVLEHVVRV”可能与TCR结合，因此是基于T细胞免疫疗法的靶标。因此，MAGE
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A抗原及其表位肽已用于肿瘤免疫疗法试验。
[0004]虽然在开发用于癌症治疗的分子靶向药物方面取得了进展，但是，本领域仍然需要开发抗癌新药，其特异性靶向作用于对癌细胞具有高度特异性但对正常细胞不具特异性的分子。
[0005]因此，本专利技术提出了新型抗原结合蛋白，其对与MHC蛋白形成复合体的SEQ ID NO:1的肿瘤表达抗原MAGE
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A具有特异性。
[0006]WO 2017/158103公开了TCR，更特别是天然TCR(例如，天然TCR R7P1D5)，其与具有SEQ ID NO:1的KVLEHVVRV的氨基酸序列的MAGE
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A抗原肽和HLA I类分子的复合体结合，以及这些TCR在诊断、治疗和预防癌性疾病中的用途。但是，相较于与MHC提呈病毒抗原特异性结合的TCR，与MHC提呈癌症抗原特异性结合的天然T细胞受体(TCR)亲和力通常较低(K
D
＝1
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300μM)。此现象的部分解释似乎为：胸腺中发育的T细胞在自身pep
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MHC配体上被负选择(耐受诱导)，从而删除了对此类pep
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MHC亲和力过高的T细胞。这种低亲和力是肿瘤免疫逃逸的一种可能解释(Aleksic et al.2012,Eur J Immunol.2012Dec；42(12):3174
‑
9)。因此，似乎需要设计与癌症抗原具有更高结合亲和力的TCR变体，用作过继细胞疗法(ACT)中的抗原识别构建体，或者作为可溶性方法的识别模组，即，使用双特异性分子(Hickman et al.2016,J Biomol Screen.2016Sep；21(8):769
‑
85)。
[0007]但是，增加TCR的亲和力也可能增加副作用的风险。如上所述，自然中抗肿瘤相关抗原(自身蛋白)的高亲和力TCR透过胸腺选择被排除，从而避免透过交叉反应识别存在于正常组织上的自身肽。因此，简单增加TCR对靶序列的亲和力也可能增加相似非癌特异性肽
的亲和力，从而增加交叉反应的风险和对健康组织的有害细胞毒性作用。对于靶向作用于MAGE
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A3的改造TCR，已痛苦地发现这不仅仅是理论上的风险。特别是，之前发表的结果显示：两名患者发生致命的毒性，这两名患者输注了经改造以表达靶向作用于MAGE
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A3的TCR的T细胞，该TCR与肌肉蛋白Titin中的肽发生交叉反应，但临床前研究中未预测到交叉反应性(Linette GP et al.Blood 2013；122:863
–
71,Cameron BJ,et al.Sci.Transl.Med.2013；5:197
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103)。这些患者表明，TCR改造的T细胞可能具有严重且不可预测的脱靶和器官特异性毒性。
[0008]因此，存在尚未满足的医疗需求，即开发并提出以更高亲和力与其靶标特异性结合的TCR或抗原结合蛋白，从而甚至可靶向作用于靶抗原肽表达较低的肿瘤细胞或细胞系降低，同时由于与脱靶肽(也称为“相似肽”)的交叉反应较低或降低而保持高安全性特征。换言之，专利技术人能够开发出对其靶肽表现出高结合亲和力同时又保持高肿瘤选择性的抗原结合蛋白。
[0009]此外，如专利技术人所示，MAGE
‑
A特异性TCR分子TCR R7P1D5作为单链构建体或称为TCER的双特异性形式(以下称为“TCER
TM”分子或“TCER
TM”)显示了相对较低的溶解度，TCER
TM
包含与T细胞上表面分子特异性结合且与MHC
‑
肽复合体特异性结合的部分。
[0010]因此，尽管TCR技术取得了进步，但是仍然需要额外的癌症疗法，特别是有效靶向作用于并杀死癌细胞的癌症疗法。特别是，需要开发新的抗原结合蛋白，其i)对于与具有所需生物学活性的MHC蛋白形成复合体的SEQ ID NO:1的肿瘤特异性MAGE
‑
A肽具有选择性和特异性，ii)具有良好的代谢、药代动力学、溶解性、稳定性和/或安全性特征，和iii)可大规模生产。
[0011]因此，在本专利技术背景下，专利技术人改造了几种抗原结合蛋白，其包含衍生自所述亲本TCR R7P1D5的CDR变体。这些抗原结合蛋白对肽
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MHC复合体的结合亲和力增加且稳定性增加和/或溶解性增加，使其更适合用于医疗用途。
[0012]此外，如本专利技术人本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.种抗原结合蛋白，其与MAGE
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A抗原肽特异性结合，所述MAGE
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A抗原肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列“KVLEHVVRV”或由其组成，其中所述抗原肽与主要组织相容性复合体(MHC)蛋白形成复合体，所述抗原结合蛋白包含a)包含第一可变结构域的第一条多肽链，所述第一可变结构域包含三个互补决定区(CDR)CDRa1、CDRa2和CDRa3，其中：
‑
CDRa1包含氨基酸序列“X1SSSTY”SEQ ID NO:72或由其组成，其中X1为任何氨基酸，或与SEQ ID NO:72不同的氨基酸序列，不同点为：至少有一个氨基酸取代基，
‑
CDRa2包含氨基酸序列“IX1SX2X3DX4”SEQ ID NO:73或由其组成，其中X1至X4为任何氨基酸，
‑
CDRa3包含氨基酸序列“CAEX1X2SX3SKIIF”SEQ ID NO:77或由其组成，其中X1至X3为任何氨基酸，前提是：如果CDRa1包含氨基酸序列SEQ ID NO:5或由其组成并且CDRa2包含氨基酸序列SEQ ID NO:6或由其组成，则CDRa3不包含“CAEYSSASKIIF”(SEQ ID NO:7)也不是由其组成，优选前提是：CDRa3不包含“CAEYSSASKIIF”(SEQ ID NO:7)也不是由其组成，(b)包含第二可变结构域的第二条多肽链，所述第二可变结构域包含三个CDR
‑
CDRb1、CDRb2和CDRb3，其中：
‑
CDRb1包含氨基酸序列“X1GHDY”SEQ ID NO:78或由其组成，其中X1为任何氨基酸，或与SEQ ID NO:78不同的氨基酸序列，不同点为：至少有一个氨基酸取代基，
‑
CDRb2包含氨基酸序列“FX1X2X3X4P”SEQ ID NO:79或由其组成，其中X1至X4为任何氨基酸，
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CDRb3包含氨基酸序列“CASRAX1TGELFF”SEQ ID NO:82或由其组成，其中X1为任何氨基酸，或与SEQ ID NO:82不同的氨基酸序列，不同点为：至少有一个氨基酸取代基。2.根据权利要求1中所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白与所述抗原肽的SEQ ID NO:1氨基酸序列“KVLEHVVRV”特异性结合，并且其中所述抗原肽与MHC蛋白形成复合体，其中，优选为MHC蛋白为人白细胞抗原(HLA)蛋白，优选为HLA
‑
A*02。3.根据权利要求1或2所述的抗原结合蛋白，其中，所述抗原结合蛋白与表位特异性结合，所述表位包含SEQ ID NO:1的MAGE
‑
A抗原肽的至少三个氨基酸位置或由其组成，优选为至少三个氨基酸位置选自由SEQ ID NO:1氨基酸序列的氨基酸位置1、5、7和8或1、3、5和7组成的组。4.根据权利要求1至3任一项所述的抗原结合蛋白，其中，所述抗原结合蛋白与所述MAGE
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A抗原肽与HLA
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A*02之复合体结合，所述MAGE
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A抗原肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或由其组成，其K
D
≤100μM、≤50μM、≤30μM、≤25μM、≤1μM、≤500nM、≤100nM、≤50nM、≤10nM，优选为50pM至100μM、50pM至10μM、50pM至1μM，更优选为50pM至500nM、50pM至100nM、50pM至50nM和50pM至10nM。5.根据权利要求1至4任一项所述的抗原结合蛋白，其中，所述抗原结合蛋白对MAGE
‑
A/MHC复合体提呈细胞的EC
50
值小于100nM、小于50nM、小于10nM、小于900pM、小于500pM、小于300pM、小于200pM、小于150pM、小于100pM、小于50pM、小于20pM、小于10pM，例如0.1nM至20nM，例如0.5nM至15nM、0.8nM至12nM、0.8nM至10nM、0.8nM至10nM、0.8nM至10nM或例如1pM至150pM、1至100pM、1至50pM、1至20pM、1至20pM。6.根据权利要求1至5任一项所述的抗原结合蛋白，其中，当选自由RABGAP1L
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001、
AXIN1
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001、ANO5
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001、TPX2
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001、SYNE3
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001、MIA3
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001、HERC4
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001、PSME2
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001、HEATR5A
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001、CNOT1
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003、TEP1
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003、PITPNM3
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001、INTS4
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002、SAMH
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001、PPP1CA
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006、RPL
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007、SETD1A
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001、NOMAP
‑1‑
0320、NOMAP
‑1‑
1223和ODC
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001，优选为HEATR5A
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001和CNOT1
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003组成的列表中的肽与MHC蛋白形成复合体，优选与HLA
‑
A*02形成复合体时，所述抗原结合蛋白不与所述肽显著结合。7.根据权利要求1至6任一项所述的抗原结合蛋白，其中，抗原结合蛋白为抗体或其片段，或双特异性抗体或其片段，或T细胞受体(TCR)或其片段，或双特异性T细胞受体(TCR)或其片段。8.根据权利要求1至7任一项所述的抗原结合蛋白，其中，第一多肽和第二多肽被共价或非共价连接在一起。9.根据权利要求8所述的抗原结合蛋白，其中，所述抗原结合蛋白为单链TCR(scTCR)或单链双特异性抗体。10.根据权利要求1至9任一项所述的抗原结合蛋白，其中，所述第一可变结构域还包含选自由FR1
‑
a、FR2
‑
a、FR3
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a和FR4
‑
a组成组中的一个或多个框架区，其中
‑
FR1
‑
a包含SEQ ID NO:83氨基酸序列或与SEQ ID NO:83具有至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列或由其组成，
‑
FR2
‑
a包含SEQ ID NO:84氨基酸序列或与SEQ ID NO:84具有至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列或由其组成，
‑
FR3
‑
a包含SEQ ID NO:85氨基酸序列或与SEQ ID NO:85具有至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列或由其组成，
‑
FR4
‑
a包含SEQ ID NO:86氨基酸序列或与SEQ ID NO:86具有至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列或由其组成，和所述第二可变结构域还包含选自由FR1
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b、FR2
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b、FR3
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b和FR4
‑
b组成组中的一个或多个框架区，并且其中
‑
FR1
‑
b包含SEQ ID NO:87氨基酸序列或与SEQ ID NO:87具有至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列或由其组成，
‑
FR2
‑
b包含SEQ ID NO:88氨基酸序列或与SEQ ID NO:88具有至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列或由其组成，
‑
FR3
‑
b包含SEQ ID NO:89氨基酸序列或与SEQ ID NO:89具有至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列或由其组成，或
‑
FR4
‑
b包含SEQ ID NO:90氨基酸序列或与SEQ ID NO:90具有至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列或由其组成。11.根据权利要求10所述的抗原结合蛋白，其中，框架区包含至少一个选自包含以下的氨基酸取代基组中的氨基酸取代基：
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FR1
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a中第19位置处的氨基酸取代基，其中所述氨基酸取代基优选为S19A、S19V，更优选为S19V，
‑
FR2
‑
a中第48和/或第50位置处的氨基酸取代基，其中所述第48位置处的氨基酸取代基优选为A48K，所述第50位置处的氨基酸取代基优选为L50P，
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FR2
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b中第46、47和/或54位置处的氨基酸取代基，其中所述第46、47和54位置处的氨
基酸取代基分别优选为M46P、M47G和I54F，其中，当上面定义的CDRb3氨基酸序列在第109位置处包含氨基酸109D时，优选第54位置处的所述氨基酸为I54F，
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FR3
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b中第66位置处的氨基酸取代基，其中所述第66位置处的氨基酸取代基分别优选为I66C，其中，当上面定义的CDRb2氨基酸序列在第57位置处包含氨基酸57C时，优选第66位置处的所述氨基酸为66C，其中取代基的位置根据IMGT命名法给出。12.根据权利要求11所述的抗原结合蛋白，其中，所述第一可变结构域还包含选自由FR1
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a、FR2
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a、FR3
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a和FR4
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a组成组中的一个或多个框架区，其中
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FR1
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a包含SEQ ID NO:91氨基酸序列或与SEQ ID NO:91具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成，其中优选为与SEQ ID NO:91具有至少85％同一...

【专利技术属性】
技术研发人员：M，
申请(专利权)人：伊玛提克斯生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：