中华小长臂虾微孢子虫绝对荧光定量PCR检测方法、试剂盒及引物技术

一种中华小长臂虾微孢子虫绝对荧光定量PCR检测方法、试剂盒及引物，属于分子生物学技术领域。具体检检测方法：采集样本；中华小长臂虾微孢子虫DNA的提取；合成扩增片段大小为141bp的上下游引物；绝对荧光定量PCR方法的建立；标准曲线的绘制；绝对荧光定量PCR方法的灵敏度和特异性试验。本发明专利技术建立快速，灵敏的中华小长臂虾微孢子虫分子检测方法，与传统的PCR检测方法相比，具有省事、高效、灵敏、定量的特点。特点。特点。

【技术实现步骤摘要】
中华小长臂虾微孢子虫绝对荧光定量PCR检测方法、试剂盒及引物


[0001]本专利技术属于分子生物学
，特别是涉及一种中华小长臂虾微孢子虫绝对荧光定量PCR检测方法、试剂盒及特异性引物。

技术介绍

[0002]微孢子虫最早被报道于1857年，(Nageli 1857)，是典型的专性胞内寄生的单细胞真核生物，微孢子虫自身具有着独特的特征，如独特的侵染装置，孢子发芽时弹出极丝，将具有感染性的胞原质运输到细胞内。国际动物命名委员会(ICZN)已确定微孢子虫门包括200多个属(Becnel et al.，2014)。 Thelohania属侵染直额长臂虾(Palaemon rectirostris)、锯齿长臂虾 (Palaemon serratus)和海洋褐虾(Crangon vulgaris)和淡水龙虾和奥斯塔欧洲鳌虾(Astacus fluviatilis)等虾类(Edgerton BF et al，2002； Stentiford GD et al，2013)。
[0003]Enterocytospora artemiae(EAM)最早发现于2013年，它被认为是一种专性于卤虫的寄生虫，仅限于欧洲和美洲(Rode等人，2013年)。然而，在2020 年，发现这种微孢子虫已经蔓延到亚洲，并感染了具有重要经济意义的中华小长臂虾(Jiang et al.,2020)。EAM主要寄生于中华小长臂虾的肝胰腺。EAM感染严重时会导致肝胰腺发白病变，并大大降低中华小长臂虾的活力，使其生长缓慢、发育停滞。虽然死亡率不高，但这些微孢子虫对宿主营养的吸收导致繁育成本增加。
[0004]目前，对于EAM的检测主要有光学显微、电子显微镜镜观察、组织病理切片，但是这些技术分别使用时，却各有其局限性。电镜观察耗时长，费用高并需要具备特殊放入实验器材视野狭窄，感染宿主的微孢子虫数量较低时，通过传统染色、光学显微镜或电子显微镜进行观察变得无效，从而无法准确测定各种微孢子虫。组织病理切片虽组织结构保存良好，在病理和回顾性研究中有较大的实用价值，但观察需要大量虫体，不适用于早期检测，操作繁琐，费时费工；常规PCR灵敏度低、不能准确、定量的检测EAM及其在宿主组织中的寄生活性。相比之下，实时荧光定量PCR(qPCR)，具有优势：如高特异性和高灵敏度，消耗更少时间，并可得知初始DNA模板的拷贝数。qPCR检测过程是在一个相对封闭、独立的系统中完成，防止样品和环境的交叉污染(Kotkov
á
等人，2018年；Li等人，2019年)。

技术实现思路

[0005]针对上述存在的中华小长臂虾微孢子虫诊断技术检测灵敏度不高、操作频繁、检测时期较晚等技术问题，本专利技术提供一种中华小长臂虾微孢子虫 Enterocytospora artemiae(EAM)绝对荧光定量PCR检测方法、试剂盒及特异性引物，它可以快速诊断中华小长臂虾微孢子虫的特异性引物及SYBR Green荧光定量PCR检测，使得中华小长臂虾微孢子虫检测的灵敏度和特异性得到很大程度的增强，并避免了漏检和误解。
[0006]本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：
[0007]本专利技术一种中华小长臂虾微孢子虫绝对荧光定量PCR检测的特异性引物，根据中华小长臂虾微孢子虫的靶基因序列，合成扩增片段大小为141bp的上下游引物，所述引物的序列如下：
[0008]上游引物为:5
’‑
ATTCCCTCGTTCGTTGAGTCAGATTG
‑3’
，
[0009]下游引物为：5
’‑
GTGGCATTGTCATCATCCCTTTGTTG
‑3’
，
[0010]引物浓度有要求为10μM/μL。
[0011]一种中华小长臂虾微孢子虫绝对荧光定量PCR检测的试剂盒，包括权利要求1所述的上下游引物以及中华小长臂虾微孢子虫质粒标准品。
[0012]进一步地，所述中华小长臂虾微孢子虫质粒标准品由Eb99F/Eb99R引物进行扩增得到目的片段制备而成，
‑
20℃保存。
[0013]本专利技术所述的引物在中华小长臂虾微孢子虫绝对荧光定量PCR检测中的应用。
[0014]一种中华小长臂虾微孢子虫绝对荧光定量PCR检测方法，绝对荧光定量 PCR方法的建立：使用2
×
ChamQ Universal SYBR qPCR MasterMix试剂进行绝对荧光定量PCR方法的建立，反应体系为20μL，2
×
ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10.0μL，上下游引物各0.4μL，ddH20 7.2μL，模板 2μL；加样时先将引物和ddH2O均匀混合并分装到反应管，后加均匀混合好的模板和2
×
ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix，上机器前离心处理；
[0015]反应条件为：预变性95℃ 30s，1个循环；变性95℃ 10s，退火 60℃ 30s，延伸72℃ 30s，40个循环。
[0016]进一步地，所述荧光定量PCR标准曲线的绘制：
[0017](1)制备含扩增靶序列的阳性质粒作为阳性标准品；
[0018](2)将构建标准重组质粒换算拷贝数后，进行连续的10倍梯度稀释，从 7.7
×
100到7.7
×
108共设置9个浓度梯度，每个梯度设置6个重复，于荧光定量 PCR仪中进行扩增，各取2μL当做模板，同时设置以ddH2O为模板为阴性对照；
[0019](3)扩增结束后收集数据，根据扩增屈曲线、Ct值，每个浓度重复3次进行检测，得出最佳的检测区间，并绘制标准曲线。
[0020]本专利技术的有益效果为：
[0021]本专利技术利用荧光定量PCR(qPCR)的技术原理，我们专利技术了一种用于中华小长臂虾微孢子虫检测的SYBR Green荧光定量PCR方法，实现了对EAM的快速准确检测的目的。由于该方法加入了特异性扩增引物和SYBR Green Mix体系，使得EAM的灵敏度和特异性得到很大程度的增强，使用该方法获得的检测数据可作为快速、准确识别EAM感染及预防和控制EAM的技术参考。
附图说明
[0022]图1为不同稀释梯度标准质粒的常规PCR电泳图；其中：
[0023]泳道M：DL1000Marker；
[0024]泳道1
‑
9：7.4
×
108‑
7.4
×
100稀释不同梯度的标准质粒。
[0025]图2A、2B未常规PCR扩增特异性片段电泳图及荧光定量PCR。
[0026]泳道P:阳性对照；
[0027]泳道1
‑
7依次为：中华小长臂虾微孢子虫阳性DNA、河蟹微孢子虫总DNA、轮虫DNA、
二尖梅奇酵母菌DNA、肝肠胞虫DNA、白斑综合征病毒本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种中华小长臂虾微孢子虫绝对荧光定量PCR检测的特异性引物，其特征在于：根据中华小长臂虾微孢子虫的靶基因序列，合成扩增片段大小为141bp的上下游引物，所述引物的序列如下：上游引物为:5
’‑
ATTCCCTCGTTCGTTGAGTCAGATTG
‑3’
，下游引物为：5
’‑
GTGGCATTGTCATCATCCCTTTGTTG
‑3’
，引物浓度有要求为10μM/μL。2.一种中华小长臂虾微孢子虫绝对荧光定量PCR检测的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的上下游引物以及中华小长臂虾微孢子虫质粒标准品。3.根据权利要求1所述的用于中华小长臂虾微孢子虫绝对荧光定量PCR检测的试剂盒，其特征在于：所述中华小长臂虾微孢子虫质粒标准品由Eb99F/Eb99R引物进行扩增得到目的片段制备而成，
‑
20℃保存。4.如权利要求1
‑
2任一项所述的引物在中华小长臂虾微孢子虫绝对荧光定量PCR检测中的应用。5.一种中华小长臂虾微孢子虫绝对荧光定量PCR检测方法，其特征在于：绝对荧光定量PCR方法的建立：使用2
×
ChamQ Universal SYBR qPCR...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜宏波，刘京慧，包杰，陈启军，
申请(专利权)人：沈阳农业大学，
类型：发明
国别省市：