一种船舶压载水微藻含量的原位检测方法技术

本发明专利技术属于船舶压载水微藻含量检测技术领域，具体涉及一种船舶压载水微藻含量的原位检测方法。所述方法利用荧光探针的发射峰与压载水微藻叶绿素a的吸收峰高度重叠，发生竞争发射，引起探针荧光强度的改变，建立微藻密度与探针发光强度之间的关系模型，从而快速计算压载水样本中微藻的生物量。本发明专利技术采用近红外光(NIR)作为激发光源，光毒性低、背景荧光低、检测灵敏度高；采用的无机上转换纳米粒子，其光物理化学性质稳定、无光闪烁、无光漂白现象，并且适用于有腐蚀性的压载水环境；表面功能化修饰赋予探针良好的水溶性以及生物相容性，可直接进入微藻细胞，实现压载水中微藻细胞数量的原位快速检测。的原位快速检测。的原位快速检测。

【技术实现步骤摘要】
一种船舶压载水微藻含量的原位检测方法


[0001]本专利技术属于船舶压载水微藻含量检测
，具体涉及采用表面功能化的红色上转换纳米荧光探针，通过竞争性荧光分析法，实现微藻含量的原位快速检测。

技术介绍

[0002]随着社会的快速发展，经济趋于全球化，国际经济贸易日益繁荣，船舶承载着90％以上的货运任务。为了通过调整船舶的吃水和稳定，减少船体变形和船体阻力并降低船体的振动，改善船舶的适航性，船舶普遍使用水作为压载物。然而，船舶压载水的排放也成为了海洋生物和病原体传播的主要途径，日益严重地破坏着海洋生物链，给全球经济造成了极大的损失，已被被国际海事组织(IMO)认定为海洋所面临的四大威胁之一。压载水传播的外来生物中微藻占很大一部分比例，微藻入侵使世界各地海岸饱受“赤潮”影响，造成当地生物生病或死亡、破坏当地生态系统及鱼类资源和休闲设施等，这些微藻在富营养化的水体中还会大量繁殖，在世界范围内造成巨大的经济及环境损失(国际航行船舶压舱水生物监测调查报告，航海技术，2003，26，2
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4)。因此，压载水在排放之前必须对其中的微藻进行严格的处理，然后再利用一定的技术手段进行取样分析，确认处理后的压载水满足排放标准，且不得造成船期延误。然而，目前仍然缺乏船舶压载水微藻含量的快速、准确、灵敏的检测方法。
[0003]目前压载水中微藻含量的主要检测方法有：1)显微计数法，该方法通过将微藻样品加入血细胞计数器并置于显微镜下，根据细胞的大小、形态、颜色来判断微藻细胞的活性，从而计数，但是该方法需要实验人员具备专业的生物学知识、人工成本高、误差大、工作强度大以及效率低，难以实现快速检测；2)流式细胞术法,该方法利用荧光染料标记微藻细胞，将微藻细胞制成悬浮液，利用流式细胞仪测量微藻细胞的光信号，从而判断微藻的含量，这种方法具有准确、效率高的优点，但缺点是需要昂贵的设备和训练有素的人员、样品前处理繁琐，难以实现压载水船基快速检测；3)叶绿素检测法，该方法以叶绿素a的含量作为测定微藻生物量的有效指标，主要通过吸收分光光度法和荧光分光光度法测量叶绿素a的浓度。其中，吸收分光光度法是利用藻类叶绿素a在400
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460nm以及650
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680nm范围内的吸光度评估细胞密度和微藻生物量(同步荧光法测定海水中叶绿素a的含量，分析仪器，2004，3，24
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26)；荧光分光光度法则是利用微藻中叶绿素a在420nm蓝光激发下发射680nm红光的特性，通过测量微藻在680nm处的荧光强度，进而标定藻类生物量。但是所有这些基于叶绿素含量的现有检测方法均需要首先萃取微藻中的叶绿素，需要经过滤、研磨、冷藏、离心等步骤，步骤繁琐，耗时长，需要专业人员操作，无法实现船基快速检测。同时，在叶绿素萃取过程需要使用丙酮(酸)、甲醇等有机溶剂，对环境造成危害。目前在文献及专利报道中，尚缺乏一种简单、快速、可靠的检测方法获得压载水微藻生物量。

技术实现思路

[0004]针对以上现有技术的不足，本专利技术提供一种快速检测压载水微藻含量的原位检测
方法。这种方法利用表面功能化的上转换纳米探针与压载水微藻细胞结合，通过荧光探针与微藻细胞内叶绿素a发生竞争发射，通过测量发光光谱实现对压载水微藻含量的快速检测。
[0005]该方法与现有基于叶绿素的检测方法相比，无需提取叶绿素，大大简化了检测步骤，缩短检测时间，从而快速、准确判断压载水存活微藻生物量是否达到排放要求。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案实现的：
[0007]一种船舶压载水微藻含量的原位检测方法，包括以下步骤：
[0008]步骤1)：将表面功能化的上转换纳米荧光探针分散在溶剂中，配制成浓度为1
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10mol/L的探针储备液A；
[0009]步骤2)：取含不同微藻生物量的压载水水样，将探针储备液A分别加入各组压载水水样中共同孵育，进行荧光光谱测量，利用微藻细胞内叶绿素a在红光区的吸收和探针在红光区的发射高度重叠，发生竞争发射，引起探针的荧光强度发生改变的特点，建立压载水水样微藻生物量与探针荧光强度之间的关系曲线；
[0010]步骤3)：取待测压载水水样，加入探针储备液A，共同孵育后，进行荧光光谱测量，根据步骤2)建立的微藻生物量与探针荧光强度之间的关系曲线，获得待测压载水水样中的微藻生物量。
[0011]上述技术方案中，进一步地，所述步骤1)中的溶剂包括二甲基亚砜、乙醇、N，N
‑
二甲基甲酰胺中的一种或两种以上。
[0012]上述技术方案中，进一步地，所述步骤1)中，表面功能化的上转换纳米荧光探针以750～850nm、940～1100nm、1450～1600nm中的一个或两个以上波长作为近红外光激发源波长，发射光为位于640
‑
670nm的红色荧光。
[0013]上述技术方案中，进一步地，孵育时间为0.2
‑
2h。
[0014]上述技术方案中，进一步地，将探针储备液A加入压载水水样共同孵育，使上转换纳米荧光探针的浓度为0.1
‑
1mol/L。
[0015]上述技术方案中，进一步地，所述微藻包括小球藻、扁藻、叉鞭藻、新月藻、三角褐指藻、角毛藻、海链藻或杜式盐藻。
[0016]上述技术方案中，进一步地，所述步骤1)中表面功能化的上转换纳米荧光探针的制备方法包括以下步骤：
[0017](1)使用高温热分解法或高温共沉淀法制备长碳链配体包覆的上转换纳米粒子，随后将长碳链配体包覆的上转换纳米粒子分散在有机溶剂中；
[0018](2)将NOBF4溶于溶剂a，与长碳链配体包覆的上转换纳米粒子混匀，产生沉淀，随后离心，得到表面为BF4‑
的裸纳米粒子；
[0019](3)将步骤(2)得到的裸纳米粒子溶于溶剂b，加入带端基的高分子聚合物混匀，随后加入不良溶剂c使产生沉淀，离心，得到功能化的上转换纳米荧光探针。
[0020]上述技术方案中，进一步地，所述步骤(1)中的上转换纳米探针以氟化物、氧化物、硫氧化物、钼酸盐、钒酸盐、铌酸盐、磷酸盐、钨酸盐、钛酸盐、硅酸盐或碲酸盐为基质；稀土离子RE为发光中心，RE为Ce、Pr、Nd、Sm、Eu、Tb、Dy、Ho、Er、Tm或Yb中的一种或两种以上；长碳链配体溶剂为油胺、油酸、十二硫醇中的一种或两种以上；有机溶剂为环己烷、甲苯、苯、氯仿、四氯化碳、己烷或戊烷中的一种或两种以上；纳米粒子尺寸为10～100nm。
[0021]上述技术方案中，进一步地，所述步骤(2)中，带端基的高分子聚合物中，高分子聚合物包括PEG、PVP、PAA、PEI、磷脂中的一种或两种以上，端基包括磷酸基团、羧基、氨基中的一种或两种以上；带端基的高分子聚合物的分子量为1
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20k；溶剂a包括乙醇、二氯甲烷、环己烷、石油醚中的一种。
[0022]上述技术方案中，进一步地，所述步骤(3)中，溶剂b包括二本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种船舶压载水微藻含量的原位检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1)：将表面功能化的上转换纳米荧光探针分散在溶剂中，配制成浓度为1
‑
10mol/L的探针储备液A；步骤2)：取含不同微藻生物量的压载水水样，将探针储备液A分别加入各组压载水水样中共同孵育，进行荧光光谱测量，由于微藻细胞内叶绿素a与探针在红光区产生竞争发射，从而建立压载水水样微藻生物量与探针荧光强度之间的关系曲线；步骤3)：取待测压载水水样，加入探针储备液A，共同孵育后，进行荧光光谱测量，根据步骤2)建立的微藻生物量与探针荧光强度之间的关系曲线，获得待测压载水水样中的微藻生物量。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤1)中的溶剂包括二甲基亚砜、乙醇、N，N
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二甲基甲酰胺中的一种或两种以上。3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤1)中，表面功能化的上转换纳米荧光探针以750～850nm、940～1100nm、1450～1600nm中的一个或两个以上波长作为近红外光激发源波长，发射光为位于640
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670nm的红色荧光。4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，孵育时间为0.2
‑
2h。5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，将探针储备液A加入压载水水样共同孵育，使上转换纳米荧光探针的浓度为0.1
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1mol/L。6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述微藻包括小球藻、扁藻、叉鞭藻、新月藻、三角褐指藻、角毛藻、海链藻或杜式盐藻。7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤1)中表面功能化的上转换纳米荧光探针的制...

【专利技术属性】
技术研发人员：田莹，辛芳云，付姚，邢明铭，庞强，李佳瑶，
申请(专利权)人：大连海事大学，
类型：发明
国别省市：