基于不对称PCR检测镉离子的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于不对称PCR检测镉离子的方法，包括以下步骤：1)将待测溶液样品加入到含有C1和C2的缓冲液中进行反应，其中，所述C1为Cd

【技术实现步骤摘要】
基于不对称PCR检测镉离子的方法


[0001]本专利技术涉及一种基于不对称PCR检测镉离子的方法，属于镉离子浓度检测


技术介绍

[0002]镉离子(Cd
2+
)是一种带有高毒性的重金属离子，它能够导致多种疾病以及癌症的发生，严重影响着人们的身体健康。由于它具有生物累计效应，即使在低浓度下，它也可能对人类健康造成严重的损害。为此，美国环境保护署(EPA)规定了饮用水中的Cd2+含量不得高于45nM。因此，开发一种高灵敏度的Cd2+检测方法有重大意义。
[0003]到目前为止，已经开发了许多技术和方法来检测Cd
2+
，这些方法大致分为仪器方法(例如电感耦合等离子体质谱和原子吸收光谱法)，化学分子探针，蛋白质生物传感器和DNA生物传感器。但是用PCR法高灵敏检测Cd
2+
还未见报道。PCR技术是一种非常成熟的DNA扩增技术，可使靶标DNA特异地扩增上百万倍，目前已成功用于新冠病毒检测、分子诊断及癌症早期筛查。

技术实现思路

[0004]基于上述，本专利技术提供一种抗干扰、可高灵敏检测镉离子的基于不对称的PCR检测方法。
[0005]本专利技术的技术方案是：基于不对称PCR检测镉离子的方法，包括：
[0006]1)将待测溶液样品加入到含有C1和C2的缓冲液中进行反应，其中，所述C1为Cd
2+
‑
适配体，所述C2为适配体的互补链；
[0007]2)加入核酸外切酶进行反应；
[0008]3)加入引物P2和2
×
Taq Master Mix进行PCR反应，其中，所述引物P2为与所述C2配对的PCR引物；
[0009]4)加入DNA荧光染料，根据荧光信号判定镉离子的有无及浓度。
[0010]可选的，镉离子浓度在0nM
‑
500nM范围内，镉离子浓度和荧光比值的线性方程为：
[0011]Y＝0.99203+0.0076X(R2＝0.988)
[0012]其中，Y为荧光比值，X为镉离子浓度，所述荧光比值为待测溶液样品的荧光与空白对照组的荧光的比值，所述空白对照组为不含镉离子的溶液样品的荧光。
[0013]可选的，镉离子浓度在0nM
‑
500nM范围内，镉离子浓度和荧光值的线性方程为：
[0014]Y＝23698600+166714.99X(R2＝0.986)
[0015]其中，Y为荧光值，X为镉离子浓度。
[0016]可选的，所述C1的DNA序列如SEQ ID NO.1所示，所述C2的DNA序列如SEQ ID NO.2所示。
[0017]可选的，所述P2的DNA序列如SEQ ID NO.4所示。
[0018]可选的，所述缓冲液为Tris
‑
HCl缓冲液，pH为8.7。
[0019]可选的，加入核酸外切酶后的反应时间为50min。
[0020]可选的，所述PCR的反应程序为：94℃8min；94℃15s，50℃15s，70℃10s，30个循环，72℃5min。
[0021]可选的，所述DNA荧光染料为SG I荧光染料，浓度为4
×
(7.84μM)。
[0022]本专利技术的工作原理是：设计四条ssDNA：C1，C2，P1和P2(如表1)。其中，C1为Cd2+
‑
适配体，C2为适配体的互补链，P1和P2分别为与C1和C2配对的PCR引物。如图1所示，检测前，缓冲液中C1和C2拟合成C1
‑
C2双链DNA结构。当加入待测溶液样品后，如果存在Cd
2+
，则C1和Cd
2+
可以形成发夹结构，使得C2从C1
‑
C2双链体结构中释放出来。在这种情况下，C1和C2作为单链状态，不能被核酸外切酶(Exo III)消化。随后，C2用作PCR的模板，进行PCR扩增。然后，通过添加DNA染料(SG I)可以观察到强烈的荧光信号，从而达到检测Cd
2+
的目的。当待测溶液样品中不存在Cd
2+
时，C1
‑
C2双链结构可以被核酸外切酶(Exo III)消化。因此，由于缺乏模板，无法启动PCR反应。由于核酸外切酶(Exo III)在PCR中可以被高温灭活。因此，PCR产物不受核酸外切酶(Exo III)的影响。因此，当待测溶液样品中存在Cd
2+
离子时，最终会发出荧光，反之，则不会发出荧光。
[0023]本专利技术的有益效果是：本专利技术首次实现了利用不对称PCR对Cd
2+
进行检测，具有抗干扰性好、灵敏度高的优点。此外，本专利技术方法所用试剂都已商品化，且用到的仪器设备也比较常见，在一个PCR管中即可完成，较为简单实用。
附图说明
[0024]图1：基于Exo III和PCR双扩增策略的Cd
2+
检测方法的示意图；
[0025]图2：对称PCR(左边)和不对称PCR(右边)流程示意图；
[0026]图3：不同退火温度(53℃、52.6℃、51.7℃、50.1℃、48.1℃、46.6℃、45.5℃、45℃)下对称(紫色柱)和非对称(绿色柱)PCR的比较，F和F0是存在和不存在Cd
2+
(5μM)时的荧光信号，误差棒代表三个重复测量中的相对标准偏差；
[0027]图4：4A.不同条件下的荧光光谱:a,C1
‑
C2+Cd
2+
+Exo III+P2+2
×
Taq Master Mix,(红线)；b,C1
‑
C2+Exo III+P2+2
×
Taq Master Mix(蓝线).图4B：不同处理的样品进行琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖浓度为3％。泳道1：DNA marker，泳道2：C1
‑
C2+Exo III+P2+2
×
Taq Master Mix，泳道3：C1
‑
C2+Cd
2+
(5μM)+Exo III+P2+2
×
Taq Master Mix；
[0028]图5：(A)不同缓冲液下的荧光信号变化(F/F0)。(B)不同pH值的Tris
‑
HCl缓冲液下的荧光信号变化(F/F0)。(C)Exo III反应时间的优化。(D)SG I浓度对荧光信号的影响。F和F0是存在和不存在Cd
2+
(5μM)时的荧光信号。误差棒代表三个重复测量中的相对标准偏差；
[0029]图6：(A)存在不同浓度Cd
2+
的荧光发射光谱，(B)在不同浓度的Cd
2+
中525nm处的荧光信号的变化(F/F0)，插图：F/F0在0
‑
500nm Cd
2+
浓度范围内本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于不对称PCR检测镉离子的方法，其特征在于，包括：1)将待测溶液样品加入到含有C1和C2的缓冲液中进行反应，其中，所述C1为Cd
2+
‑
适配体，所述C2为适配体的互补链；2)加入核酸外切酶进行反应；3)加入引物P2和2
×
Taq Master Mix进行PCR反应，其中，所述引物P2为与所述C2配对的PCR引物；4)加入DNA荧光染料，根据荧光信号判定镉离子的有无及浓度。2.根据权利要求1所述的基于不对称PCR检测镉离子的方法，其特征在于，镉离子浓度在0nM
‑
500nM范围内，镉离子浓度和荧光比值的线性方程为：Y＝0.99203+0.0076X(R2＝0.988)其中，Y为荧光比值，X为镉离子浓度，所述荧光比值为待测溶液样品的荧光与空白对照组的荧光的比值，所述空白对照组为不含镉离子的溶液样品的荧光。3.根据权利要求1所述的基于不对称PCR检测镉离子的方法，其特征在于，镉离子浓度在0nM
‑
500nM范围内，镉离子浓度和荧光值的线性方程为：Y＝2369...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹国英，杨华林，张建华，郭玉双，贾蒙骜，罗晓，张盼，彭西英，
申请(专利权)人：贵州省烟草科学研究院，
类型：发明
国别省市：