一种微流控血液及血制品细菌污染检测方法技术

本发明专利技术涉及一种微流控血液及血制品细菌污染检测方法，包括以下步骤：(1)模拟细菌污染血液标本的制备；(2)细菌计数及细菌基因组DNA的提取：提取上述细菌污染模拟血液标本的DNA，并对提取的DNA进行核酸浓度检测，选取浓度达标的DNA，保存备用；(3)微流控芯片FQ

【技术实现步骤摘要】
一种微流控血液及血制品细菌污染检测方法


[0001]本专利技术涉及医学检测
，尤其涉及一种微流控血液及血制品细菌污染检测方法，其中该血液及血制品尤其为血小板制品。

技术介绍

[0002]血液和血液制品的微生物污染是影响输血安全的重要因素之一，近年来，虽然随着检测试剂及检测技术的发展，经输血途径感染乙肝、艾滋、梅毒等常规血液传染病的风险已明显降低，但是血液细菌污染仍然无法避免。血液及血制品细菌污染主要因素有：静脉采血不当、献血员为无症状菌血症、保存不当等。其中，血小板更易受到细菌的污染，并且造成的临床危害也更严重，此外，血小板必须在22℃振荡培养的条件下以保持其活性，这也为大部分病原菌的生存提供了条件。
[0003]目前，可通过多种方法或工具来对血液及血制品的细菌污染进行检测，例如，申请号为CN201410781842.5(公开号为CN104502589A)的中国专利技术专利《一种检测血小板制品细菌污染的层析试纸条及检测方法》、申请号为CN201910589644.1(公开号为CN110456049A)的中国专利技术专利《一种血小板制品细菌污染检测的方法》等。其中，基于血培养的BacT/ALERT 3D自动化系统是目前最常用检测血液及血制品细菌污染的方法，但是该方法存在以下问题：成本高，耗时长，在诊断时效性上存在明显欠缺，还可能因此而降低血液制品的治疗效用；此外，敏感性不高，对于某些难以培养的细菌容易产生假阴性结果。近年来，随着实时荧光定量PCR技术的成熟，逐渐有取代传统方法的趋势，例如，申请号为CN201410363658.9(公开号为CN104372072A)的中国专利技术专利《一种通用型检测血小板细菌污染的荧光定量PCR方法》等。然而，将PCR技术应用于血液及血制品细菌污染检测时，核酸扩增反应需要提取、扩增及检测等步骤，既费时又费力，因此还需要进一步改进。

技术实现思路

[0004]本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术而提供一种检测效率高、检测敏感性高且检测结果准确率高的微流控血液及血制品细菌污染检测方法。
[0005]本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种微流控血液及血制品细菌污染检测方法，其特征在于包括以下步骤，
[0006](1)模拟细菌污染血液标本的制备：挑取污染模拟细菌进行培养，培养至一定浓度后与备用的无菌血小板浓缩液混合，混合液经稀释后获得所需的细菌污染模拟血液标本；
[0007](2)细菌计数及细菌基因组DNA的提取：提取上述细菌污染模拟血液标本的DNA，并对提取的DNA进行核酸浓度检测，选取浓度达标的DNA，保存备用；
[0008](3)微流控芯片FQ
‑
PCR反应：设计FQ
‑
PCR引物及Tagman探针，利用微流控芯片中进行PCR反应并收集荧光数据。
[0009]进一步，所述步骤(1)中的污染模拟细菌包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。血液及血制品的自然细菌污染源(主要为人体皮肤表面细菌)包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性
菌，本专利技术中的污染模拟细菌包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌能更好地模拟自然细菌污染源。
[0010]进一步，所述革兰氏阳性菌为金黄色葡萄球菌，所述革兰氏阴性菌为铜绿假单胞菌单菌。金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌单菌均为人体皮肤表面的常见致病菌，其中，金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌的代表菌，而铜绿假单胞菌单菌为革兰氏阴性菌的代表菌。
[0011]进一步，所述步骤(1)中的细菌污染模拟血液标本中的细菌浓度为100～108CFU/mL。
[0012]进一步，所述步骤(2)中提取的DNA的浓度标准为：A260/A280值在1.8～2.0之间，A230/A260值小于0.7，从而避免假阴性结果，提高检测的灵敏度，有利于保证检测结果的可靠性。
[0013]进一步，所述步骤(3)中的FQ
‑
PCR引物的序列为：
[0014]上游5
’‑
CCTACGGGNGGCWGCAG
‑3’
，如SEQ ID NO.1所示。
[0015]下游5
’‑
CTTTACGCCCARTAATTCCG
‑3’
，如SEQ ID NO.2所示。本专利技术中的引物特异性高，能有效避免假阴性或假阳性问题的发生，进一步提高检测结果的准确性。
[0016]进一步，所述步骤(3)中所用的探针为Tagman探针，并且该Tagman探针序列为：5
’
FAM
‑
CGTATTACCGCGGCTGCTGCAC
‑
TAMRA 3'，如SEQ ID NO.3所示。
[0017]进一步，所述步骤(3)中的FQ
‑
PCR反应的反应条件为：7℃预变性8s，以97℃7s、60℃14s、扩增40循环，在60℃进行单点荧光检测。
[0018]进一步，所述步骤(3)微流控芯片包括16条U型毛细管道状的通道，各通道能分别进行FQ
‑
PCR反应，从而能同时检测16个PCR反应，进一步提升本专利技术的检测效率。
[0019]与现有技术相比，本专利技术的优点在于：本专利技术将FQ
‑
PCR技术与微流控芯片相结合来检测样本中的细菌16srDNA，通过检测结果来评价样品的细菌污染情况，与普通的培养法相比，具有高效、高灵敏以及高精度的优点，能实现对血液及血制品细菌污染的快速、高灵敏以及高可靠性的实时检测，且不会降低血液及血制品的治疗效用。可见，本专利技术能为血液及血制品(尤其是血小板制品)的细菌污染检测技术的发展提供理论基础。
附图说明
[0020]图1为本专利技术实施例3中金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌基因组浓度梯度标准曲线。
具体实施方式
[0021]以下结合附图实施例对本专利技术作进一步详细描述。
[0022]实施例1：试验材料及仪器
[0023](1)菌毒株与血液标本
[0024]金黄色葡萄球菌(Staphylococeucus aurs,ATCC 25293)，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,2265)均由本实验室保存。
[0025]机采血小板标本采自健康献血者，志愿者需满足以下条件：
[0026](1)年龄在18至55岁之间；(2)体重大于等于50公斤；(3)未孕；(4)没有严重的疲劳、贫血、胰岛素依赖型糖尿病或传染病；(5)排除正在接受某些医学治疗(例如抗生素，全
身性皮质类固醇或抗癫痫治疗)的志愿者；(6)献血前均未使用抗生素等药物。
[0027](2)仪器与试剂
[0028]恒温摇床(上海，一恒科学仪器)；
[0029]生物安全柜(上海，力申科学仪器)；
[0030]分光光度计(德国，Eppendorf公司)；
[0031]超微量分光光度计(美国，DeNovix公司)核酸提取仪(西安，天隆科技)；
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种微流控血液及血制品细菌污染检测方法，其特征在于包括以下步骤，(1)模拟细菌污染血液标本的制备：挑取污染模拟细菌进行培养，培养至一定浓度后与备用的无菌血小板浓缩液混合，混合液经稀释后获得所需的细菌污染模拟血液标本；(2)细菌计数及细菌基因组DNA的提取：提取上述细菌污染模拟血液标本的DNA，并对提取的DNA进行核酸浓度检测，选取浓度达标的DNA，保存备用；(3)微流控芯片FQ
‑
PCR反应：设计FQ
‑
PCR引物及Tagman探针，利用微流控芯片进行PCR反应并收集荧光数据。2.如权利要求1所述的微流控血液及血制品细菌污染检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中的污染模拟细菌包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。3.如权利要求2所述的微流控血液及血制品细菌污染检测方法，其特征在于，所述革兰氏阳性菌为金黄色葡萄球菌，而所述革兰氏阴性菌为铜绿假单胞菌单菌。4.如权利要求1所述的微流控血液及血制品细菌污染检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中的细菌污染模拟血液标本中的细菌浓度为100～108CFU/mL。5.如权利要求1所述的微流控血液及血制品细菌污染检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中提取的DNA的浓度标准为：A260/A280值在1.8～2.0之间，A230/A260值小于0.7。6.如权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：俞露，贺云蕾，邓刚，沈龙强，张继伟，许德义，刘奕宇，
申请(专利权)人：宁波市中心血站，
类型：发明
国别省市：