一种检测微卫星不稳定的分子标志物及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种检验肿瘤细胞微卫星不稳定的新分子标志物及其应用。该分子标志物是组蛋白去乙酰化Sirtuin家族成员SirT7。本发明专利技术发现人肿瘤组织中SirT7与DNA损伤修复系统蛋白MSH2的蛋白表达呈负相关，从而确定SirT7是显示肿瘤组织微卫星不稳定性的新的分子标志物。另一方面，肿瘤细胞微卫星不稳定预示肿瘤耐药性。因此，本发明专利技术进一步发现肿瘤细胞中SirT7会引起化疗药物处理下的微卫星不稳定，敲低SirT7的肿瘤细胞对多种化疗药物呈现敏感性。因此，本发明专利技术将SirT7作为肿瘤微卫星不稳定性的新的分子标志物，预测肿瘤耐药性，为肿瘤化疗药物的针对性选择提供可能性，为肿瘤精准治疗提供新思路。治疗提供新思路。治疗提供新思路。

【技术实现步骤摘要】
一种检测微卫星不稳定的分子标志物及应用


[0001]本专利技术涉及肿瘤耐药性预测及检测领域。具体地，本专利技术涉及一种检测微卫星不稳定的分子标志物及应用。

技术介绍

[0002]基因损伤药物引起的细胞死亡是抗肿瘤治疗的核心。虽然目前抗肿瘤治疗取得巨大进展，但是基因损伤药物耐药性的出现极大制约了肿瘤治疗的有效性。因此，深入研究肿瘤耐药的原因以及如何及时检测药物敏感性对肿瘤药物治疗至关重要。DNA损伤压力应激被认为是影响DNA损伤药物有效性的原因，DNA损伤压力会导致DNA双链或者单链损伤，进而激活细胞内DNA损伤修复系统，修复DNA损伤，抑制细胞死亡，从而导致肿瘤耐药。然而，细胞内存在一类高保真DNA错配修复(MMR)系统，对细胞内碱基之间的错配和碱基的插入/删除的错配进行修复，保持基因组稳定性。而且MMR对DNA损伤造成的凋亡起到重要的起始作用。在缺乏或失活MMR的肿瘤细胞中，会造成单个或两个核苷酸重复序列缺失的产生，导致不同长度的重复，引起基因组不稳定性，也叫做微卫星不稳定(MSI)，引起肿瘤对药物的耐受性。大量研究已经证明MSI成为肿瘤耐药的标志。因此，如何有效快速检测微卫星的状态将有效预测肿瘤药物敏感性与耐受性。大量研究表明，MSI与结直肠癌、胃癌、子宫内膜癌等发生密切相关；进一步的研究表明，很多肿瘤的发生如肺癌、食道癌、膀胱癌、甲状腺癌等均与微卫星不稳定密切相关。MSI的检测具有多重临床病理意义。大约15％的结直肠癌中存在MSI现象，其中典型的遗传性非息肉病性结直肠癌(HNPCC)患者90％以上为MSI瘤。与无MSI的结直肠癌相比，携带有MSI的结直肠癌其预后较好，并且二者药物反应也不一样。
[0003]现有技术的微卫星不稳定性一般可通过如下2种方法检测，检测项目有MLH1、MSH2、MSH6和PMS2：
[0004]1)PCR法：选定特异的引物，以自身正常组织作对照，在体外对微卫星位点进行PCR扩增，扩增后的产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳，经各种显示系统(放射自显影、银染等)分析有无迁移率的改变。
[0005]2)基因检测，即对相关的DNA直接进行测序。但因进行基因检测价格昂贵，所需试验条件较高，在临床应用尚未普及。
[0006]PCR法已成为目前常用检测方法并已被证明是最有效的初筛手段。但普通PCR分管检测五个微卫星基因，产物做凝胶电泳的方法，存在操作繁琐、成本高等诸多缺陷。多重PCR检测微卫星基因，引物间的竞争与干扰因素较为复杂，扩增产物不容易错开，会直接导致检测结果的不确定性，因此，多重PCR检测产品对于反应体系中引物序列的特异性和引物的浓度都有很高的要求。
[0007]目前临床中微卫星不稳定性检测方法主要依赖于美国肿瘤研究所制定的检测标准，即检测两个单核苷酸重复位点(BAT-25，BAT-26)和三个二核苷酸重复位点(D2S123，D5S346，D17S250)共五个基因组微卫星位点的稳定性。这种方法通过PCR扩增然后通过电泳实验对比肿瘤样本和正常对照样本在目标重复区域的拷贝数情况来决定微卫星位点的稳
定性。根据检测样本中不稳定性位点占总检测位点数的比例可以将样本微卫星不稳定性状态确定为高不稳定(MSI-H)，低不稳定(MSI-L)和稳定(MSS)三种状态。这种检测方法检测位点过少，实验方案复杂，耗费时间较长。近期对癌症样本的基因组测序数据的研究表明，具有MSI-L和MSS表型的样本没有显著差异，PCR电泳实验的方法并不能得到这一结论。虽然一些专利或者文献提出，增加MSI检测位点并设计实验来增加检测的准确率，但是这种基于PCR和电泳实验的检测方法不能进行高通量自动化进行，同时检测位点增加将会增加实验的难度和成本，不能从根本上解决问题。与此同时这种基于PCR和电泳实验的检测方法的实验步骤复杂，价格昂贵，并且需要正常组织和肿瘤组织作对照。
[0008]除了通过对微卫星位点的检测来判断微卫星不稳定性，目前主流的方法还有免疫组化的方法，即通过抗原抗体杂交检测肿瘤中与错配修复系统相关的基因的表达情况来确定微卫星不稳定性的状态。这种方法虽然灵敏度较高，但与上述实验方法一样，同样试验复杂，可重复率低，且需要正常样本作对照。
[0009]组蛋白去乙酰化酶Sirtuin家族是调控肿瘤化疗耐药中非常关键的一类蛋白，它们是与酵母Sir2同源的相关酶类。Sirtuin家族由七个成员组成，SirT1-7，它们都有一个保守的NAD依赖的催化核心区，促进NAD依赖的去乙酰化酶活性以及ADP核糖转移酶活性。Sirtuins依赖于其去乙酰化活性，参与调控细胞的代谢、衰老、增殖、抗压及炎症氧化应激反应等。Sirtuins具有复杂的促癌或抑癌作用，其中SirT7是Sirtuin家族中唯一定位在核仁的蛋白，大量的癌症研究将SirT7归为原癌基因，一方面SirT7通过去乙酰化H3K18维持癌症的特征，另外一方面SirT7促进rDNA转录这一功能也正好符合癌细胞快速增殖对核糖体生成的需要。SirT7自身并没有表现出原癌基因的特性，因为过表达SirT7并不能导致原生纤维母细胞发生癌变，因此认为在癌细胞中SirT7过量表达可能是为了满足快速增殖的癌细胞对核糖体生成的需求。最近报道SirT7通过去琥珀酰化H3K22促进染色体凝集以及参与双链DNA损伤(DSB)修复，这些研究揭示SirT7可能作为肿瘤研究的热点蛋白，研究SirT7与肿瘤耐药的关系与调控将变得极为有意义，有利于寻找肿瘤化疗药物耐药性预测标志物，可实际用于临床肿瘤预测预后与指导化疗用药。
[0010]本专利技术将研究SirT7与肿瘤微卫星不稳定性的关系，目的是提出肿瘤微卫星不稳定性检测的新分子标志物，用于预测肿瘤耐药。

技术实现思路

[0011]本申请的目的在于提供一种高灵敏度、高特异性、可实际应用于检测肿瘤微卫星不稳定性的新的分子标志物以及在肿瘤耐药性中的应用。为了实现上述目的，本专利技术通过以下技术方案予以实现：
[0012]作为本专利技术的第一个方面，在于提供一种检测微卫星不稳定的分子标志物，所述分子标志物为SirT7水平。
[0013]优选的，SirT7水平作为分子标志物的应用，所述SirT7水平为细胞中SirT7的NDA水平或SirT7蛋白水平。
[0014]优选的，细胞中所述SirT7蛋白水平的检测方法为，在肿瘤组织或细胞中，免疫组化检测、Western blot检测或ELISA检测SirT7蛋白水平，从而预测肿瘤微卫星稳定性，其中，高表达的SirT7蛋白水平提示肿瘤微卫星不稳定性、低表达的SirT7蛋白水平提示肿瘤
微卫星稳定性。
[0015]优选的，所述肿瘤组织包含但不限于乳腺癌组织，细胞类型包含但不限于MCF-7细胞系。所述肿瘤组织还可以为结直肠癌、胃癌、子宫内膜癌、肺癌、食道癌、膀胱癌或甲状腺癌。
[0016]优选的，所述SirT7蛋白水平体现SirT7蛋白表达情况，所述SirT7蛋白表达情况包括高表达、中等表达和低表达。
[0017]作为本专利技术的第二个方面，在于提供了一种预测肿瘤化本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测微卫星不稳定的分子标志物，其特征在于，所述分子标志物为SirT7水平。2.根据权利要求1所述的SirT7水平作为分子标志物的应用，其特征在于，所述SirT7水平为细胞中SirT7的NDA水平或SirT7蛋白水平。3.根据权利要求2所述的SirT7水平作为分子标志物的应用，其特征在于，通过检测细胞中所述SirT7蛋白水平预测肿瘤微卫星稳定性，方法为，在肿瘤组织或细胞中，采用免疫组化检测、Western blot检测或ELISA检测SirT7蛋白水平，高表达的SirT7蛋白水平提示肿瘤微卫星不稳定性、低表达的SirT7蛋白水平提示肿瘤微卫星稳定性。4.根据权利要求3所述的SirT...

【专利技术属性】
技术研发人员：王传贵，孙莲慧，
申请(专利权)人：南通思特康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：