胶体金颗粒标记的抗体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及胶体金颗粒标记的抗体及其应用。本发明专利技术针对CEA靶标制备并获得了高活性的单克隆抗体，并针对该抗体开发了新的胶体金颗粒标记方法，本申请制备的胶体金，保证各检测线显色清晰的基础上，能进一步加快试纸条的检测速度，保证试纸条的检测准确度。采用该单克隆抗体制备的试剂盒具有较好的检测特异性，具有良好的应用前景。有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
胶体金颗粒标记的抗体及其应用


[0001]本专利技术涉及检测领域，更具体的，涉及一种胶体金颗粒标记的抗体及其应用。

技术介绍

[0002]癌胚抗原(CEA)是一种分子量为180
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200kDa的多糖蛋白复合物.1965年首先由加拿大学者从结肠腺瘤和胎儿肠中提取的一种肿瘤相关抗原。主要存在于直肠.结肠癌组织和胚胎肠粘膜上。因这种抗原也存在于2
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6个月胚胎的胃肠、肝脏和胰腺组织中.故名癌胚抗原，也称胚胎抗原(EA)或胎儿抗原(FA)。
[0003]CEA作为最常用的肿瘤标志物，广泛应用于多种肿瘤的诊断，已成为临床诊断的重要辅助指标之一。健康者血清CEA水平一般小于5ng/mL。恶性肿瘤可导致CEA表达水平明显升高，当其持续升高5～10倍时，提示可能存在肠癌。以CEA水平升高为首发表现的甲状腺髓样癌，提示在鉴别CEA升高的疾病时，应考虑甲状腺髓样癌的可能。CEA表达水平与肿瘤临床分期密切相关。有研究显示，胃癌患者CEA阳性率随胃癌分期递增而升高，IA、IB、Ⅱ、ⅢA、ⅢB、Ⅳ期胃癌患者CEA阳性率分别为4.6％、12.3％、27.80％、39.1％、48.3％、53.0％。乳腺癌患者CEA表达水平与疾病临床分期也呈正相关，随着临床分期升高而增高。
[0004]CEA可用于肿瘤术后疗效评价，术后CEA水平明显降低表示手术效果较好。在有效的结直肠癌切除术后，外周血CEA水平一般在4～6周恢复正常水平，若超过6周仍未恢复正常，提示肿瘤有可能早期复发。在肿瘤治疗方法中，放化疗和手术治疗一样重要。在放化疗过程中，应定期检测血清CEA水平，以监测放化疗疗效。一般而言，CEA水平在放疗后明显降低。
[0005]传统的测定CEA含量的方法是免疫分析法，是建立在抗体一抗原的专一性和灵敏性的基础上。自上世纪40年代以来.陆续出现了免疫荧光技术、放射免疫技术及免疫酶技术三大经典免疫技术。三大经典免疫技术的相继问世一次次地推动着免疫技术的发展。免疫荧光技术启动了标记抗原抗体的可能.放射免疫技术将免疫测定的灵敏度推上一个巅峰.而免疫酶技术则开拓了免疫技术的视野。而近年来发展起来的化学发光免疫检测和电化学免疫检测以及蛋白芯片技术更是进一步推动了I临床检测技术的发展用。目前，临床上用来检测CEA浓度的方法主要有酶联免疫吸附测定、荧光免疫测定、放射免疫测定、电化学发光免疫测定、安培免疫测定、免疫金标技术以及蛋白芯片技术。
[0006]免疫金标记技术(immunogold labeling technique，ICG)是以胶体金为标记物.利用特异性抗原抗体反应.在光镜电镜下对抗原或抗体物质进行定位、定性乃至定量研究的标记技术。研究表明对同一标本同时采用放射免疫法、酶联免疫法和金标法进行CEA检测，结果表明金标法是一种简便易行的初筛方法。目前金标技术主要朝着高灵敏度、多元化检测、定量或半定量检测方向发展。但是针对CEA的检测还有进一步提高的空间，针对CEA检测的胶体金颗粒标记方法也有待进一步的提高，特别是针对CEA的更优的抗体研究也有待进一步的提高。

技术实现思路

[0007]本专利技术克服现有技术的缺陷，提供一种改进的胶体金颗粒标记方法，以及针对CEA的单克隆抗体以及真对该抗体开展的标记方法及试剂盒。
[0008]一方面，本专利技术提供一种针对CEA的单克隆抗体4D05，该抗体的轻链可变区(SEQ ID NO：1)
[0009][0010]重链可变区(SEQ ID NO：2)
[0011][0012]其中，本专利技术还提供了一种包含编码上述氨基酸序列的多核苷酸序列或组合的重组DNA表达载体；所述重组DNA表达载体的DNA序列中进一步的包含编码抗4D05抗体的上述重链可变区、重链恒定区、轻链可变区和轻链恒定区的氨基酸序列。
[0013]其中，本专利技术还提供了一种转染上述重组DNA表达载体的宿主细胞，所述宿主细胞包含原核细胞、酵母、昆虫或哺乳动物细胞。
[0014]其中，所述原核细胞优选大肠杆菌。
[0015]其中，所述哺乳动物细胞优选HEK293E细胞、CHO细胞或NS0细胞。
[0016]进一步的，本专利技术的单克隆抗体还可以通过小鼠腹水来产生。
[0017]进一步的，本专利技术还提供一种胶体金颗粒标记方法，所述方法具体包括以下步骤：将实验用的各种玻璃器具均需要经蒸馏水多遍洗净并用双蒸水多次冲洗，烘干；并将器皿放入浓硫酸溶液中浸泡24h超纯水多遍浸泡冲洗，烘干，避免粉尘等污染。经高压灭菌进行灭菌处理，最后经过去离子水冲洗多遍，高温干燥，备用。制备胶体金：取250mL三角瓶一个，加双蒸水及1％氯化金溶液，用0.22μm滤膜过滤，加热沸腾。取柠檬酸钠先用0.22μm滤膜过滤，再加入上述溶液中，迅速混合均匀，再保持沸腾时间10min，在上述搅拌过程中，锥形瓶中溶液颜色呈现由浅黄色一紫色一酒红色的变化过程，取下锥形瓶冷却至室温，并用双蒸水补充至原体积K2CO3调节pH 6.5，制备成酒红色的胶体金溶液，经0.22μm滤膜过滤，用紫外
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可见光分光光度计在可见光(400
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600nm)范围内扫描胶体金溶液，得到胶体金可见光光区的最大吸收波长为521nm，而且吸收峰宽度较小，说明胶体金溶液颗粒大小均匀，质量较好。将胶体金按照1/10(V/V)的比例加入的4D05单克隆抗体溶液，室温反应后，加入聚乙二醇，离心，吸去上清。用含牛血清白蛋白(BSA)的PBS洗涤。最后沉淀重悬于相当于原体积1/5的1％BSA溶液中，4℃保存即制备获得胶体金颗粒标记的单克隆抗体。通过采用上述技术方案，若胶体金的粒径过大，则会影响胶体金在检测垫上的移动速度，若胶体金的粒径过小，则会影响各检测线的显色深浅。两者均会影响检测人员对检测结果的读取，降低试纸条的检测准确度。本申请制备的胶体金，保证各检测线显色清晰的基础上，能进一步加快试纸条的检测速度，保证试纸条的检测准确度。
[0018]进一步的，本专利技术还提供一种胶体金标记抗体制备的检测试剂盒，所述试剂盒含有试纸条，所述试纸条的制备方法包括：用加样器将的0.5
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5mg/L浓度的4D05单克隆抗体溶液以及兔抗鼠IgG溶液以直线的形式平行点加到NC膜上的A、B处，A与B之间间距为3mm；胶体
金标记抗体的固化：取已用含BSA的PBS稀释的胶体金标记抗CEA单克隆抗体溶液等体积混合，加至结合物垫上，干燥备用；试剂条的黏贴、组装：按常规方式组装，首先将包被了抗体的NC膜黏贴于单面胶的塑料底板上，再依次黏贴胶体金结合物垫、样品垫以及吸水垫。
[0019]进一步的，将所述各垫装入一个盒体中，所述的盒体对应于样品垫的部位设有加样孔，所述的盒体对应于检测线和质控线的部位设有观测窗以及检测线和质控线的位置标识。
[0020]具体的，所述NC膜还可以是醋酸纤维素膜或混合膜；所述样品垫可以是玻璃纤维或聚酯纤维或混合纤维；所述吸水垫由吸水材料制备，如吸水纸。
[0021]更进一步的，所述NC本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种针对CEA的单克隆抗体4D05，该抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO：1所示；重链可变区序列如SEQ ID NO：2所示。2.一种采用胶体金颗粒标记的权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于:所述胶体金颗粒标记方法为将胶体金按照1/10V/V的比例加入0.3mg/mL的4D05单克隆抗体溶液，室温反应15min后，加入1％聚乙二醇，8000r/min离心30min，吸去上清；用含1％牛血清白蛋白的0.02...

【专利技术属性】
技术研发人员：詹先发，柳静，
申请(专利权)人：北京科跃中楷生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：